利用水动力聚焦法连续制备二甲素，实现二甲素向囊泡的转变

Bicelle是一种最稳定的磷脂组合物，由于其具有生物膜模拟特性和较高的热稳定性，在药物输送和膜蛋白结构研究等领域有着广泛的应用。但传统的二甲醚制备方法工艺复杂、时间长，因此利用微流控芯片连续合成二甲醚的方法在扩大其可行性方面发挥了重要作用。我们验证了用微流控芯片进行流体聚焦法合成二甲醚的普遍有效性，该方法使用相变温度范围为−2 ~ 41℃的各种脂类。只有当微流控芯片内部温度超过相变温度时，才会形成Bicelle。此外，二头肌形成的浓度条件因脂质的不同而不同。从有效q值、混合时间和稀释条件等方面分析了二状体向囊泡转变的过程特征。我们验证了过渡泡的大小受有效q值、混合时间和温度的控制。

脂质囊泡由于具有细胞膜的拟态性，在生物化学和自然科学中具有重要作用。1，2］．在水溶液中，磷脂自组装，防止其疏水尾巴暴露在水溶液缓冲液中，从而形成各种类型的结构，如双层胶束或囊泡。

双层胶束具有盘状结构，其结构由两部分组成:双层结构域部分和单层边缘部分，这两部分分别由长链脂类和短链脂类组成。由于双分子层结构域的疏水区域被短链脂质覆盖，且结构稳定，双分子层结构是磷脂组合中最稳定的结构[3.］．其自稳定的特性使其在室温下的保留期延长至数周，这意味着二甲醚是功能材料结合的给药系统的合适载体[4，5，6］．此外，bicelle可以用作囊泡前物质，注意到它可以通过稀释方法简单地过渡到囊泡结构[7］．

尽管bicelle在生物医学领域有着巨大的可行性，但其传统的制备方法，即薄膜水化法，其制造过程漫长而复杂[8］．这些制造过程还需要苛刻的条件，如反复冷冻和解冻，这导致生物物质的理化特性变性[9］．因此，要求采用温和条件下连续生产二甲醚的方法。我们课课组之前提出了不消耗能量的微流控法合成bicelle，如图所示。1(10］．在本研究中，为了验证微流控芯片的流体动力聚焦方法的普遍有效性，研究了不同种类的磷脂在- 2 ~ 41℃的相变温度下形成二尖瓣的浓度和温度条件。进一步，如图4所示。1B，用简单稀释搅拌法将制备的二甲醚转化为囊泡，并考察其转化特性。

材料

SU-8 2100负光刻胶(PR)购自MicroChem, SI晶圆片(525\ (\ mathrm{\μm} \)厚度)被用来制造一个硅主模具。软成型用聚二甲基硅氧烷(PDMS, Sylgard184，与10:1固化剂配比混合)购自道康宁;1, 2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC T_米= 23°C)， 1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷酸胆碱(POPC, T_米=−2℃)，1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC, T_米= 41°C)和1,2-二己基-锡-甘油-3-磷酸胆碱(DHPC)从Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AL, USA)采购，用于制备DMPC/DHPC bicelle溶液。磷酸缓冲盐水(PBS)， 1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH)和6-十二烷基-n, n -二甲基-2-萘胺(Laurdan)从Sigma-Aldrich公司(St. Louis, MO, USA)获得，用于分析膜性能(流动性和极性)。甲醇购自大钟化学金属有限公司(韩国)。

微流控芯片的制备

根据负PR工艺手册和SI晶圆普通光刻工艺制作了主模。以80 μm的厚度均匀涂覆PR，在60°C和90°C下依次烘烤。在强度为10 mJ/s的紫外光下，用掩膜对硬化的PR进行处理。为了去除残留的PR溶液，将紫外线暴露的SI晶圆烘烤并显影5分钟[11］．最后，完成了微流控通道SI主模的制作。

为了制备微流控芯片，将PDMS基聚合物和固化剂按10:1的重量比混合，浇铸在SI母模上，在真空室中脱气。脱气的PDMS溶液在70°C的对流烘箱中固化2小时，并小心地从SI主模中分离硬化的重复件。通过等离子体处理将复制体与平面PDMS板结合，实现PDMS微流控芯片的密封。将粘合的芯片在80°C的对流烘箱中固化8小时，以增强粘合[12］．

微流控芯片尺寸为11 mm × 35 mm × 8 mm。该通道由两个入口和一个出口的交叉结组成，通道的宽度和高度为80 μm(纵横比= 1)。

脂质组合物的制备

采用PDMS微流控芯片制备脂质组分。将分别溶于溶剂和PBS缓冲液(10 mM, pH 7.4)的DMPC、POPC或DPPC和DHPC等长链脂质安装在注射器上，从两个不同的入口注射。将流速比(FRR)调整为19(溶剂和缓冲相的流速为300)\ (\ mathrm{\μL} / \ mathrm {h} \)和5700年\ (\ mathrm{\μL} / \ mathrm {h} \))．将溶剂相和缓冲相分别作为内相和外相，在交点处接触，通过相互扩散进行混合，如图所示。1一个。

用简单的稀释法制备从鼻梁过渡而来的囊泡。使用10 mM PBS缓冲液进行稀释，相当于在制备bicelle溶液中使用的缓冲液。

动态光散射的尺寸表征

脂质组分的大小通过动态光散射(DLS)测量(Zetasizer Nano ZS90)测定。将约0.5 mL的样品溶液装入石英槽中，在20°C下测量散射光强(所有样品在20°C平衡1分钟后测量)。水力半径由Stokes-Einstein方程确定[13，14]:

k_B为玻尔兹曼常数，T为绝对温度，η为试样的粘度，D为扩散系数。磷脂组件的折射率和吸收值分别为1.45和0.001。分散剂的粘度和折射率分别为1.0143 cP和1.3304。

膜特性的表征

用DPH法评价脂质组合的膜流动性[15，16］．DPH在摩尔比为1:250的脂质溶液中溶解。DPH分子被插入脂膜，并在双分子层中间积累。用荧光分光光度计(SCINCO, FS-2)测定DPH的荧光各向异性。激发波长为360 nm，发射强度在430 nm处测量。膜流动性(1 / \ \ ({mathrm {p}} _ {\ mathrm{衰变时}}\))的定义如下:

在哪里\({我}_{\平行}\)而且\({我}_{\补}\)分别表示平行和垂直于水平偏振光的发射强度;而且\({i}_{\parallel}\mathrm{和}{i}_{\perp}\)分别表示垂直偏振光平行和垂直方向的发射强度。

脂质组合的膜极性用Laurdan [17，18］．劳丹在摩尔比为1:200的脂质溶液中溶解。Laurdan分子插入脂膜表面边缘，在膜表面积累。用荧光分光光度计(SCINCO, FS-2)测量劳丹的一般极化。激发波长为440 nm，发射强度在490 nm处测量。膜极性(\ ({GP} _ {340} \))方程的定义如下:

在哪里\({我}_ {440}\)而且\({我}_ {490}\)分别表示由340 nm光激发的440和490 nm的发射强度。

微流体系统中Bicelle的合成

验证二尖瓣形成的评价由三个因素:组件的大小，膜的性质，和形态分析。小尺寸的组合(< 50 nm)预计是二状体或混合胶束，这可以从膜的性质区分。混合胶束的膜由两种脂质随机组合而成，因此其膜刚性很低。另一方面，二头肌由两个脂质段明显分离，表明其双层膜组织均匀，为刚性有序相。同时，相对较大的组合(> 50 nm)可能是囊泡，根据膜的性质可分为均质和非均质囊泡。非均质膜易发生无序，因此膜的刚度相对较均质膜低。

首先考察合成产物的大小取决于长链脂质浓度，DHPC (C6)的浓度固定在20 mM，如图所示。2a，当DMPC (C14)浓度超过100 mM时，组合体尺寸急剧减小。膜极性表示脂质双分子层的填充密度，膜流动性表示双分子层膜的局部粘度。由此可见，各项性能与膜刚度分别有正、负相关关系。对于小型组件，如图5所示。2b和c, DMPC膜呈有序相，表明双层膜均质[7］．另一方面，相对较大的组件具有液晶相膜。与膜流动性相比，膜极性特别低，说明由于DHPC分子的插入，膜的有序性被打乱，即大尺寸组件的脂膜是非均匀组成的[9］．

合成的组件也通过透射电子显微镜(TEM)进行分析，如图所示。3.．通过形态学和膜性质的验证，证实了大尺寸的组合为异质囊泡。在无花果。3.B，偶有堆积，并验证其盘状，叠置如插图所示。结果表明，在高DMPC浓度的条件下，成功地制备出了双叶藻。

脂质的自组装可描述为Eq。1)从它们的合并行为。随着聚结种之间距离的减小，聚结速率加快。换句话说，在高脂质浓度下，促进了自组装。在这种水动力聚焦方法中，重要的是在适当的时间提供DHPC分子。DHPC分子应在足够的双分子层结构域形成后提供。否则，小的DMPC片段由于聚结太慢而与DHPC分子混合，无法稳定。在这种情况下，异质膜生长得更长，并最终形成囊泡。

在哪里我(\ D {} _ {} \)而且j D \ ({} _ {} \)为聚集物种的扩散系数，是聚合发生的距离，对应的反应体积，\ ({E} _ {ij} \)是聚变势能，和\ (k \)是玻尔兹曼常数。

同时合成的组装体尺寸随POPC (C18)浓度的变化如图所示。4a.与DMPC不同的是，在低浓度下合成了小尺寸的组件(~ 8 nm)。也就是说，在DHPC被提供之前，POPC结构域已经形成了适当大小的结构域，这可能是由于POPC分子之间存在强烈的疏水相互作用[19］．如图所示。4b和c，经验证，当POPC浓度低于100 mM时，双分子层是均匀的，强相互作用可以在低浓度下合成二甲酰基，但在高浓度下(> 150 mM)也会诱导形成超大的囊泡(300-450 nm)。

DPPC (C16)的实验也证实了强相互作用导致的大泡的合成，如图所示。5a. DPPC的相变温度超过20℃，使得脂质之间的相互作用得到了高度增强。DPPC在20°C下合成的囊泡比POPC大。另一方面，如图所示。5b，在高于DPPC相变温度的45℃下制备了小尺寸的组装体。在45°C合成的所有组合物，其膜显示出有序的凝胶相，表明它们被证实为双胞体。结果表明，长链脂类的浓度对微流体二环的合成起着至关重要的作用。脂类的种类决定了脂类形成二头肌的适宜条件，可通过脂类的相变温度来控制。

二头肌向囊泡的转变

DHPC分子构成双分子层结构域的边缘区域，但也单体地驻留在缓冲区。除非改变DHPC分子的水化程度，否则单体DHPC的浓度保持不变。由于这些原因，二甲溶液的稀释导致二甲dhpc与胆叶结构域的边缘区域分离，由于疏水区域暴露于缓冲液，二甲dhpc变得不稳定。当这些不稳定的结构域合并并形成囊泡时，就发生了二毛泡向囊泡的转变。在这里，我们预期过渡特性可以由bicelle的理化性质或稀释条件等多种因素控制。

有效q值表示长链脂类和短链脂类的摩尔比的实际组成。随着二头肌有效q值的增大，双分子层畴变宽，二头肌的形状由各向同性变为平面圆盘状。根据bicelle的形状和大小，稀释后可得到多样化的囊泡。如图所示。6，根据有效q值，过渡囊泡的大小完全不同。有效q值由式(2)，单体DHPC的浓度参考前人的结果[10］．为了排除DMPC浓度的影响，所有样品都在固定的DMPC浓度下制备。高效q值的二头藻往往是大尺寸的囊泡，这与二头藻双分子层域变宽和DHPC分子从其边缘快速分离有关。

在哪里\ ({q} ^ {*} \)表示有效q值和\ ([DMPC] \)，\ ({[DHPC]} _ {bicellar} \)，\ ({[DHPC]} _{总}\),\ ({[DHPC]} _{单体的}\)分别为DMPC浓度、二层DHPC浓度、总DHPC浓度和单体DHPC浓度。

此外，使用磁力搅拌器搅拌的时间也会影响过渡泡的大小。混合时间越长，聚合的碎片越多，得到的囊泡越大。因此，根据有效q值和混合时间，使用bicelles可以制备各种各样的囊泡。

与此同时，DPPC二甲醚的合成也证实了这一点。5)，温度在决定脂类组合结构方面起着重要作用。囊泡的形成可以描述为双分子层域的线张力和刚性之间的平衡(Eq。3.) [20.］．囊泡指数表明，当线张力较大或弯曲模量较小时，囊泡发生在弯曲接近球形的情况下。双分子层畴的线张力随着温度的升高而增大，其弯曲模量也随之减小，表明在高温条件下囊泡加速[21，22］．因此，提前的囊泡形成导致过渡囊泡的尺寸变小，这在图中得到了实验证实。7．

在哪里\ (r \)而且\λ(\ \)分别表示双层结构域的长度和线张力。\({\λ}_ {0}\)为未经DHPC稳定的线张力，\ (\ kappa \)为弯曲模量，\({\α}_ {b} \)一个分子稳定所获得的能量，和r \({\φ}_ {}\)是双分子层畴边缘的分数。

Bicelle具有很高的稳定性，有望在给药系统中发挥重要作用。从生产效率和保持功能材料活性的角度来看，水动力法是制备二甲醚的主要方法。本研究从实验角度考察了微流控芯片用于二环合成的可行性，并从脂质浓度和温度的角度确定了二环形成的临界条件。通过研究合成的组合物的大小、形态结构和膜性能等理化性质，确定了Bicelle的形成。

事实上，根据有效q值和稀释条件分析了二状体向囊泡的转变。由于囊泡大小对细胞吸收、运输和积累行为的影响，它是药物输送系统中的一个主要因素。通过控制混合时间，研究了三种类型的bicelle过渡囊泡的大小。此外，还证实了中间畴的线张力和弯曲模量的温度依赖性也会影响泡的大小。因此，从肱二头肌中获得了广泛的囊泡，这可能有助于扩大脂质组合的可行性。在本研究中，固定了磁力搅拌器的搅拌速度，并从温度和搅拌时间的角度研究了磁力搅拌器的过渡特性。然而，搅拌速度是一个重要的参数，因为随着搅拌速度的增加，剪切诱导的囊泡融合会加快。为了验证搅拌速度的影响，需要对实验进行整理，并希望在进一步的研究中加以解决。

本研究期间产生或分析的所有数据均包含在本出版物中。

本研究是在“农业科技发展合作研究计划(项目编号:05555555555)”的支持下开展的。PJ01574703)”由韩国国家研究基金管理的国际合作项目(NRF-2020K2A9A2A08000174)和韩国机械材料研究院基础研究项目(批准号:NK226E)，韩国食品农林技术规划与评价院(IPET)通过农畜产品安全流通管理技术开发项目(118105-3)，由农林部(MAFRA)资助。

Rda (pj01574703)， NRF (2020k2a9a2a08000174)， nk226e, mafra(118105-3)。

作者指出

1. SungHak Choi和BongSu Kang对这项工作做出了同样的贡献

作者和联系

1. 韩国首尔国立大学食品科学与生物技术系食品与生物融合研究中心

   SungHak Choi & HoSup Jung

2. 庆北大学机械工程学院，大邱，韩国

   BongSu康

3. 冈山大学环境与生命科学研究生院，日本冈山

   Toshinori Shimanouchi

4. 首尔国立大学工程学院，先进材料研究所，韩国首尔

   Keesung金

贡献

SHC和BSK设计了该研究。SH.C。和BS.K。收集数据，分析解释结果，并撰写稿件。HSJ、TS和KSK对数据进行了分析和解释。KSK。和HSJ。构思研究并协助分析。KSK、TS和HSJ构思了这项研究，解释了数据，获得了资金并审查了手稿。所有作者阅读并批准了最终稿件。

相应的作者

对应到Keesung金或HoSup荣格．

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

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