柠檬酸缓冲液和闪热对提高等离子体金纳米颗粒对丙型肝炎病毒的比例基因传感灵敏度的影响

金纳米颗粒(Au NPs)技术在病毒核酸诊断中具有巨大的潜力。尽管在这一领域取得了重大进展，但现有的文献揭示了在Au NPs上硫代核酸探针的杂交和标记所使用的条件的多样性。在这里，我们使用来自丙型肝炎病毒的探针序列来确定最佳的杂交和硫醇- au NP标记条件。在典型的聚合酶链式反应中，探针最初在高温下进行快速加热，以获得有效的退火。基于此，在目前的研究中，在65℃下研究了靶标和反义寡核苷酸(ASO)之间的杂交，并在75 - 95℃的温度下进行了瞬时加热和不加热。此外，还探讨了硫酰化ASO在有和没有柠檬酸缓冲的Au NPs上的标记效率。该研究揭示了95°C瞬时加热对高效杂交的有利作用，以及柠檬酸缓冲液的存在对Au NPs上快速有效的硫醇标记。这些条件的组合效应已被发现有利于提高使用Au NPs的比率基因传感的灵敏度。

由于先天的等离子体和电子特性，金纳米颗粒(Au NPs)在一些生物应用中获得了显著的关注[1，2，3.，4，5，6，7］．在生物传感的背景下，米尔金的开创性工作等人。，在连接巯基标记DNA到Au NPs上引发了许多机会[8］．自那以后，Au NPs在比色法、表面增强拉曼散射、电化学、分光光度法和压电[9，10，11，12，13，14，15，16，17，18］．在大多数这些技术中，硫醇标记探针和目标DNA之间的高效杂交是至关重要的。此外，巯基标记探针在Au NPs上的定量结合是提高检测效率的另一个重要因素[19，20.，21，22］．

柠檬酸包裹的Au NPs具有典型的zeta电位在- 30±10 mV范围内，表明其表面具有负电荷性质[23］．由于磷酸基带负电荷，dna的骨架上也带有类似的电荷[24］．因此，当巯基标记的dna试图与柠檬酸盐包裹的Au NPs表面结合时，由于电荷-电荷排斥，结合的效果很差[25，26］．

为了克服这一问题，开发了盐老化技术，在该技术中，外部添加的电解质(如NaCl)最大限度地减少了柠檬酸单元之间的电荷排斥以及与传入DNA的磷酸盐部分之间的电荷排斥，从而为硫代DNA创造足够的空隙，使其接近Au NPs的表面[27，28］．然而，盐老化过程需要24-48小时才能实现有效的共轭[19］．通过使用柠檬酸缓冲液调节Au NPs的pH值、丁醇中瞬间脱水(debt)等策略，已经克服了这一问题。[29，30.］．这种策略已被发现可在Au NPs上产生快速和定量的硫醇共轭。其中，利用柠檬酸盐作为缓冲液的方法具有简单、高效的优点。一般认为，当更多的DNA必须在Au NPs上结合时，需要这样的结合条件，因此以前的研究集中在高DNA与Au NPs的比值(通常为> 20)。然而，对于DNA与Au - NPs比值较低的病例，柠檬酸缓冲液的必要性尚未得到探索。

探针和目标DNA之间的成功杂交在生物传感中也至关重要。因此，杂化程度是实现这一目标的一个重要标准。在有关DNA杂交条件的文献中存在着巨大的多样性。许多报道采用37℃作为杂交温度，而将持续时间调整为1-4 h [30.，31，32，33，34］．另一方面，为了在更短的时间内实现杂交，使用了55 ~ 65℃的稍高的温度，而时间减少到20分钟[35，36，37］．很少有文献报道采用95°C短时间闪热，然后在常温下杂化[38，39］．因此，在杂交条件方面存在着显著的多样性。

另一方面，全球有1.85亿人口受到丙型肝炎病毒(HCV)的影响，这是一种血液传播病原体。众所周知，由于产生足够数量的抗体需要时间，血清学诊断通常在感染后4至6周作出反应。相反，分子诊断是首选的，因为它高度敏感，并有可能在感染后1至2周内早期发现[36］．由于到目前为止还没有获得许可的疫苗，尽管研究人员已作出努力[40]，及时发现和诊断是必要的，因为未发现和未治疗的情况可能导致肝细胞癌[41］．因此，在目前的研究中，我们利用来自HCV基因组核心区(保守区)的反义寡核苷酸(ASO)，并利用最佳杂交和柠檬酸介导的共轭条件，使其对病毒靶点进行基于Au NPs的传感。

材料和特性

柠檬酸三钠和HAuCl₄.3H₂O是从Sigma Aldrich采购的，并按照收到的标准使用。目标(5'CGGATTCGCCGACCTCATGGGGTACATCCCGCTCGTCGGC3 ')， ASO (5 ' h - aaaaaaaaaaaagccggaccccatgagggatgtcggcgaatccg3 ')和对照组(5 ' ttaccgataatcctcctccggggcataacgaatgcttatagga3 ')寡核苷酸从Eurofins Pvt Ltd购买。为了减少硫醇修饰探针的二硫键，按1:5的比例加入100 mM DTT(在100 mM磷酸钠缓冲液中，pH 8.3-8.5)，在室温下孵育1小时。用37 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na制备磷酸缓冲盐水(PBS, 1X)₂HPO₄1.8 mM KH₂阿宝₄．将25.08 mg柠檬酸三钠溶于1 mL水(100 mM)中制备柠檬酸缓冲液，用稀盐酸调节最终pH值为3.0。

使用Spectramax®iD3跟踪Au NPs基因传感分析的紫外可见光谱变化。使用Malvern Zeta粒度仪进行粒度分析。

非盟NPs-based genosensing

采用著名的Turkevich方法合成了柠檬酸稳定的Au NPs [42］．合成的Au NPs在520 nm处有较强的等离子体峰，平均水动力直径约为20 nm。在DNA检测的情况下，在PCR管中取2.5 μL的ASO和2.5 μL的靶/对照在2.5 μL的1X PBS缓冲液中混合的杂交混合物。采用两种条件进行热循环器内部的杂交:在一种情况下，杂交在65℃下进行20分钟，没有任何闪光加热，在其他情况下，在指定的较高温度(75℃30 s, 85℃30 s和95℃30 s/60 s/120 s)下进行短时间闪光加热，然后在65℃杂交20分钟。加入约50 μL的Au NPs，并加入1.75 μL和2.5 μL的5m NaCl溶液，使最终NaCl浓度分别为145 mM和340 mM，对得到的溶液进行稳定性分析。在混合缓冲液中加入0.75 μL的柠檬酸缓冲液，以确定DNA偶联对Au NPs的影响。添加盐后，520 nm处的等离子体峰吸光度和700 nm至520 nm处的吸光度比值(A_700/520)随访。

首先，采用20 wt%凝胶溶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)实验，以评估不同温度条件对ASO与目标DNA杂交效果的影响。数字1a为3 μM浓度的ASO和靶/对照dna在不同杂交条件下得到的凝胶图像。在对照实验的情况下，可以清楚地看到对应于ASO和对照的两个波段，证实探针和对照之间没有杂交发生。另一方面，在不同条件下，在目标DNA中出现的明亮的粗单条带表明ASO与目标DNA之间存在高效杂交。利用ImageJ软件(Version 1.8.0_172)对杂交DNA对应条带的进一步量化显示，与未经过任何快速加热的样品相比，经过95°C快速加热120 s的样品杂交效率提高了7.5%(图8)。1b).这些结果促使我们进一步探讨杂交条件对Au NPs DNA传感的影响。为此，我们选择了不闪热、30秒闪热和120秒闪热三种条件，温度为95°C。其中一组样品进行了基于Au NPs的传感分析，以确定闪光加热条件的影响，而另一组样品则在杂交混合物中添加柠檬酸缓冲液进行了传感分析，因为它已被证明可在几分钟内产生Au NPs上快速定量的硫醇共轭[29］．

Au NPs介导的传感试验的机制是基于以下因素。已知Au NPs的稳定性是由于表面上带负电荷的柠檬酸基团之间的静电斥力所决定的。通过Turkevich方法合成的柠檬酸盐稳定的Au NPs在紫外可见光谱中显示在520 nm处有一个等离子体峰，在大于650 nm的波长处吸光度相对较低。添加盐后，由于过量的钠离子掩盖了柠檬酸基团之间的静电斥力，Au NPs倾向于聚集。已知聚集的胶体Au NPs会降低其等离子体吸光度，并在较长的波长下表现出更高的光散射。众所周知，带负电荷的DNA在与Au NPs结合时增强了其电荷密度(zeta电位)。这种电荷密度的增强将增强纳米粒子对盐诱导的Au NPs聚集的稳定性。因此，与目标DNA序列有效杂交的Au NPs应具有更高的稳定性——与阴性/对照样品相比——从而保留来自SPR的红色。

在DNA传感的情况下，两种不同初始浓度的ASO，如1.5和3 μM与等摩尔浓度的目标/对照杂交。同时，采用两种不同的条件在盐析前对Au NPs进行硫醇共轭:(i)不添加柠檬酸缓冲液和(ii)添加0.75 μL柠檬酸缓冲液。从DNA传感研究中得到的紫外可见光谱结果如图所示。2．Au NPs在520 nm的吸光度和700 nm/520 nm的比值值(A_700/520)被选择来跟踪杂交条件对DNA传感的影响，盐腌前后的吸光度值汇总在表中1．从图中可以看出。2靶/对照添加的Au NPs在520 nm处表现出较高的吸光度值(> 0.4)和较低的a_700/520比值值< 0.4。加盐后，阳性样品(含靶材)在520 nm处的吸光度随着NaCl溶液的加入逐渐降低_700/520比率值逐渐增大。在阳性样品的情况下，在520 nm和A_700/520分别为> 0.26和< 0.5，表明Au NPs具有稳定性。在采用的不同杂交条件中，经过闪速加热的目标- aso杂交样品在520 nm处的吸光度值略高于未闪速加热的样品，但差异较小(表2)1)．另一方面，不同杂交条件下杂交种的比值值也有显著差异。图中绘制了不同杂交条件下对应的比值值。3.．

总的来说，在盐渍前，Au NPs在520 nm处的吸光度在0.40 ~ 0.43之间，而A_700/520所有样品的比率值都在0.15到0.4的范围内。当依次加入1.75 μL和2.5 μL NaCl (NaCl总加入量为4.25 μL)，使最终盐浓度分别为145和340 mM时，对目标物和对照物有较好的区分，在520 nm处吸光度高，A值低_700/520目标的比率值。从表中可以看出1经过短时加热的目标样品比未经过短时加热的目标样品显示出更小的比率值(以粗体突出显示)。这些结果表明，闪热确实在提高杂交效率方面起着积极的作用，这导致了在比率值上的更好的辨别，这通常被认为是有助于提高检测灵敏度的。

然后在实验中加入柠檬酸缓冲液，以确定DNA结合对Au NPs的影响及其后续对检测灵敏度的影响。结果发现，当柠檬酸缓冲液使用时，目标物与对照物在比率值上的区别更明显。这表明，即使DNA与Au - NPs的比例低至3.5:1时，使用柠檬酸缓冲液也有助于提高偶联效率，而现有文献报道使用的比例为20:1或更高[29］．

由于柠檬酸缓冲液在快速加热和非快速加热下的样品的比率区分方面显示了额外的好处，因此它们对应的数字照片和动态光散射(DLS)结果显示在图中。4而且5．虽然数字照片显示，在不同的测定条件下使用的Au NPs的颜色无法用肉眼分辨，但经过闪光加热的样品的DLS测量显示，经过盐析过程后，样品的粒径减小了，这解释了其较低的比率值。

该研究揭示了利用闪光加热进行高效杂交和柠檬酸缓冲液在Au NPs表面快速标记硫代DNA的有益作用。在基于Au NPs的基因传感中，这种组合被发现可以提高比率吸收值的灵敏度。可以注意到，比率值在区分单核苷酸多态性方面具有高度的决定性，如Sanromán-Iglesias等人所述．使用13、46和63纳米的金纳米颗粒[43］．我们的研究表明，采用适当的杂交条件可以进一步提高这种基于Au NPs的测定的比率灵敏度。

综上所述，我们通过PAGE实验确定了ASO与目标DNA杂交的效果，结果表明，在95°C快速加热120 s，然后在65°C孵育20 min的杂交条件下，与没有快速加热的杂交条件相比，效率提高了7.5%。在基于Au NPs的DNA传感中进一步分析了这种效应，以确定闪光加热在实际应用中的有效性。使用硫醇标记的合成寡核苷酸(来自HCV病毒基因组的核心区域)进行的DNA传感研究表明，经过短时加热的aso靶DNA杂化物比未经过短时加热的杂化物更稳定Au NPs，这可以从前者较小的比率吸收值中得到证明。此外，柠檬酸缓冲液的使用已被证明有利于硫代探针与Au NPs之间的高效共轭，即使DNA与Au NPs的比例低至3.5:1和7:1。这些结果为在DNA生物传感研究中采用合适的杂交条件提供了可能。

在当前研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。

丙肝病毒:

丙型肝炎病毒

非盟NPs:

金纳米粒子

DLS:

动态光散射

背景:

脱氧核糖核酸

使负债:

丁醇中瞬间脱水

dsDNA:

双链脱氧核糖核酸

PBS:

磷酸缓冲盐

麻生太郎:

反义寡核苷酸

页面:

聚丙烯酰胺凝胶电泳

作者感谢BITS-Pilani，海得拉巴校区为完成这项研究工作提供了所有基础设施。

不适用。

作者指出

1. 作者hirhikesh Shashi Prakash和Pranay Amruth Maroju对这项工作做出了同样的贡献

作者和联系

1. 印度特伦甘纳邦，海德拉巴，梅查尔区，卡普拉曼达尔，皮拉理工学院(BITS)生物科学系

   Hrishikesh Shashi Prakash, Pranay Amruth Maroju, Naga Sai Sriteja Boppudi和Jayati Ray Dutta

2. 印度特伦甘纳邦，海得拉巴，梅查尔区，卡普拉曼达尔，皮拉理工学院(BITS)化学系

   Aniket Balapure & Ramakrishnan Ganesan

贡献

HSP:调查，形式分析，验证。PAM:调查，形式分析，验证。NSSB:调查，形式分析，验证。AB:调查，形式分析，验证。RG:概念化，方法论，资源，监督，写作审查和编辑。JRD:概念化，方法论，资源，监督，写作审查和编辑。所有作者阅读并批准了最终稿件。

相应的作者

对应到Ramakrishnan Ganesan或Jayati射线Dutta．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者声明没有竞争的经济利益。

出版商的注意

施普林格自然对出版的地图和机构附属的管辖权要求保持中立。

开放获取本文遵循创作共用署名4.0国际许可协议(Creative Commons Attribution 4.0 International License)，该协议允许在任何媒体或格式中使用、分享、改编、分发和复制，只要您给予原作者和来源适当的署名，提供创作共用许可协议的链接，并说明是否有更改。本文中的图片或其他第三方材料包含在文章的创作共用许可中，除非在材料的信用额度中另有说明。如果材料不包含在文章的创作共用许可中，并且您的预期用途不被法律法规允许或超出了允许的用途，您将需要直接从版权所有者那里获得许可。欲查看此许可证的副本，请访问http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/．

再版和权限