低温对人诱导多能干细胞源性心肌细胞(hiPSC-CMs)电生理和机械生理的影响gydF4y2Ba

有关低温及其对心肌细胞影响的研究是必要的，因为已知类似低温的情况会诱发心律失常或心室颤动。迄今为止，已经在动物身上进行了一些研究，并以动作电位的形式研究了它们的电生理反应。然而，为了全面评估低温的影响，需要在组织水平上研究机械生理变化和电生理变化。本研究通过测量人诱导多能干细胞源性心肌细胞的场电位和收缩力，研究了培养温度对细胞生长的影响。本研究有可能进一步提高对低温对人体细胞的认识。gydF4y2Ba

温度是心肌正常工作的一个重要因素。低温可能会对心脏产生极端的影响，如QT间期和QRS间期延长[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．可在心脏组织中产生心室颤动和心律失常等影响[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．QT间期是检测心律失常的重要参数，了解QT间期的延长至关重要。有关QT间期延长的潜在离子机制已通过膜片钳测量动作电位的研究进行了讨论[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．膜片钳涉及对单个细胞及其离子电流的电生理学研究。低温在组织层面的电生理效应还有待研究。通过测量细胞外动作电位，也称为场电位，可以研究心脏组织的电生理学。通过在微电极阵列(MEA)上培养细胞，同时从MEA上测量场势，可以测量场势。市面上有几种MEAs可用于测量神经元、视网膜细胞和心肌细胞等带电细胞的场势[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

另一方面，迄今为止，低温下心肌细胞钙信号通路的相关机制已被广泛研究[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．这方面的收缩性研究也在老鼠、兔子和刺猬等动物身上进行[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．然而，在体温过低的情况下，了解人类心脏对低温的反应是至关重要的。低温的机械生理和电生理效应至今尚未得到研究。gydF4y2Ba

本研究研究了低温对人诱导多能干细胞源性心肌细胞(hiPSC-CMs)的影响。我们研究了hiPSC-CMs在37 ~ 28℃标准温度下的电生理学和收缩力。Axion生物系统公司的商用系统被用于进行这项研究。通过测量电场电位来研究电生理学，通过测量细胞与电极之间的阻抗变化来研究收缩性。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba根据场势图计算场势持续时间和场势幅值的方法，根据收缩力图计算收缩幅值和跳动持续时间的方法，gydF4y2BabgydF4y2BahiPSC-CMs在Axion生物系统孔板上培养分布的光学图像gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

代hiPSC-CMsgydF4y2Ba

本研究采用购自英国Axol Bioscience公司的hiPSC-CMs (ax2508)。将冷冻保存的心肌细胞迅速解冻，然后将其稀释在含有补充物(Axol Bioscience, ax2530-500)和10%胎牛血清的维持培养基中。在细胞培养前，纤维连接蛋白被涂在Axion生物系统的孔板上，以提高细胞的粘附性。细胞以1000细胞/mm的密度培养于孔板上gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba．每2天更换一次培养基。gydF4y2Ba

场势和收缩力的测量gydF4y2Ba

使用MEA Maestro (Axion Biosystems, USA)测量在Axion生物系统孔板上培养的细胞的电生理学和机械生理学。测得的参数和培养在孔板上的细胞如图所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．电生理学以场势的形式测量，机械生理学以收缩力的形式测量。在没有电刺激的情况下记录自发跳动。使用与MEA Maestro相连的数据采集软件AxIS Navigator记录数据。场电位持续时间(FPD)从负峰值一直测量到最后一个峰值。FPD测量使用Axion生物系统公司的心脏分析工具软件。通过测量收缩力的最高点与最低点的差值来测量收缩幅值。搏动持续时间以10%收缩和90%放松的时间差计算。系统的采样率为12.5 kHz。gydF4y2Ba

为了了解低温的影响，首先在标准37°C下测量场势，然后测量收缩力。然后将系统温度降至34℃。这是通过在AxIS Navigator软件中输入所需的温度并等待温度降低到目标温度来实现的。达到目标温度后，再观察系统5分钟，以确保温度保持恒定。之后，再次测量场势，然后测量收缩力。这个过程重复到28°C，步骤为3°C。在28℃后，将温度升高到37℃，以了解场势和收缩力参数的恢复情况。工艺流程如图所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

数据分析及统计学意义gydF4y2Ba

本研究在n = 5个生物学上独立的样本中进行。在每个样品中，选择一个微电极的数据进行分析。数据以均数±均数标准误差(S.E.M.)表示。所有统计分析均使用GraphPad Prism 7软件进行。对降温过程中收缩和电生理参数的变化进行归一化分析。场电位持续时间(FPD)和跳动持续时间已使用Fredericia的公式修正(修正的持续时间=绝对持续时间/(穗间间隔))gydF4y2Ba^{1／3gydF4y2Ba})．采用单因素方差分析确定数据的统计显著性，其次采用Tukey诚实显著性差异检验，显著性差异用*定义gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05， **p< 0.001， ***p<0.0001gydF4y2Ba

本研究遵循工艺流程gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

本研究的目的是了解低温对心肌细胞的影响。用于此目的的系统，即Axion生物系统，是高通量的，因此来自多个样本的数据可以同时记录。每个井板由16个电极组成，可以同时测量场势。用这些电极通过测量所需温度和5% CO的阻抗变化来测量收缩性gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba可按需要进行维护。gydF4y2Ba

系统温度下的场势(左)和收缩力(右)记录数据gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba，gydF4y2BabgydF4y2Ba37°C,gydF4y2BacgydF4y2Ba，gydF4y2BadgydF4y2Ba34°C,gydF4y2BaegydF4y2Ba，gydF4y2BafgydF4y2Ba31°C,gydF4y2BaggydF4y2Ba，gydF4y2BahgydF4y2Ba28°C和gydF4y2Ba我gydF4y2Ba，gydF4y2BajgydF4y2Ba加热至37°CgydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

如图所示，心肌细胞均匀分布在各电极上。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac.所有孔板细胞培养密度保持一致。本实验将系统温度降低至28℃，然后再升高至37℃，以检测电生理和机械生理参数的恢复情况。数字gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba显示了一个电极在每个测量温度下的场势和收缩力的代表性10秒记录数据。左边是场势图，右边是收缩力图。从场势和收缩力图可以看出，穗间间隔随着温度的降低而缓慢增加。也就是说，细胞的搏动率逐渐下降。从图中可以看出，在37°C时，Beat rate再次上升。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba这里需要注意的是，场势和收缩力不是同时测量的，而是依次测量的。gydF4y2Ba

数字gydF4y2Ba4gydF4y2BaA和b为场势和收缩率随温度下降的重合曲线。图中均为FPD。gydF4y2Ba4gydF4y2Baa以及图中的收缩性。gydF4y2Ba4gydF4y2BaB随着温度的降低而增加。场势第二峰的幅值也在减小。在收缩性时，收缩幅度略有减小，但与温度的减小不一致。在多个样品中，收缩的幅度有所不同。对场势和收缩力参数进行了更详细的分析，如图所示。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba．在场势情况下分析的参数为FPD、FPDc、NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba峰值振幅和NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba上升的斜率。利用收缩力数据，分析了搏动持续时间、校正搏动持续时间、搏动幅值和搏动频率。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba37 ~ 28℃不同温度下的场势重叠曲线，gydF4y2BabgydF4y2Ba在37 ~ 28℃不同温度下的收缩性重叠曲线gydF4y2Ba

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FPD从34°C时的1.81倍逐渐增加到28°C时的3.25倍(图1)。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa).当温度升高到37℃时，它恢复到原来的值。FPDc在28℃时增加到1.72倍，在31℃时增加到2.01倍，在28℃时增加到2.34倍。在所有温度下，FPD和FPDc的增加均具有统计学意义。随着温度的升高，FPDc恢复到原始值1.19±0.04倍左右。另一方面，那gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba峰幅和斜率在34°C时略有增加，然后开始下降。在34℃时，峰值振幅是原始峰值的1.20倍，在31℃时是原始峰值的0.70倍，在28℃时是原始峰值的0.53倍。同时，在34°C时，穗斜率比对照高1.15倍，在31°C时低0.73倍，在28°C时低0.18倍。当温度升高到37℃时，这两个参数都不能完全恢复到控制值。穗幅恢复了0.53倍，穗斜率恢复了0.39倍。gydF4y2Ba

在收缩性测量中，在34°C时搏动持续时间是对照的1.48倍，在31°C时增加1.96倍，在28°C时增加2.29倍。在31°C和28°C下，跳动时间的变化具有统计学意义。当温度升高到37℃时，跳动时间恢复到对照的0.88±0.12次。修正跳动时间也随温度的降低而增加，34℃时增加1.42倍，31℃时增加1.84倍，28℃时增加2.42倍。当温度升高到37℃时，校正后的跳动时间返回控制值。与此相反，收缩振幅与温度没有表现出任何特定的趋势。在一些样本中，振幅减小了，而在另一些样本中，振幅保持不变。然而，随着系统温度的降低，跳动速率持续下降。对照组自发跳动速率为0.33±0.01 Hz。在34°C时下降到0.28 Hz, 31°C时下降到0.27 Hz, 28°C时下降到0.21 Hz。 When the temperature was raised back to 37 °C, the beating shot up to 0.50 ± 0.07 Hz, which was 1.52 times that of control.

场势和收缩性参数随温度(37°C, 34°C, 31°C, 28°C，提高到37°C)的分析。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba归一化辅导gydF4y2BabgydF4y2Ba归一化校正FPD (FPDc)，gydF4y2BacgydF4y2Ba归一化幅度,gydF4y2BadgydF4y2Ba规范化的斜率,gydF4y2BaegydF4y2Ba标准化的持续时间,gydF4y2BafgydF4y2Ba规范化校正跳动时长，gydF4y2BaggydF4y2Ba归一化收缩振幅gydF4y2BahgydF4y2Ba打击率。修正持续时间=测量持续时间/(穗间间隔)gydF4y2Ba^{(1/3)gydF4y2Ba}．N = 5个生物学上独立的样本。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和Tukey诚实显著性差异检验(honest significant difference test)确定数据的统计学显著性，显著性差异定义为*p< 0.05， **p< 0.001， ***p<0.0001gydF4y2Ba

全尺寸图像gydF4y2Ba

电生理学和机械生理学的变化是在较低温度下细胞中发生的几种离子活性变化的结果。已有研究表明，温度的降低会导致细胞内钙的增加[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba］．在体温过低的情况下，过量的钙会导致心脏功能障碍[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．另外，像I这样的离子电流gydF4y2Ba_kgydF4y2Ba在低温下经历延迟激活[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．肌浆钙含量增加的综合作用gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}电流和延时IgydF4y2Ba_kgydF4y2Ba电流导致延迟复极，结果是场电位持续时间增加(图1)。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa, b). Ca的增加gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}钙离子通道的摄取和释放以及延迟的失活导致了殴打持续时间的增加(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bae, f)。峰幅和峰持续时间均有所下降，说明NagydF4y2Ba^+gydF4y2Ba电流也随着温度的降低而减小。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac, d). Na激活的延迟gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba通道导致了穗间间隔的增加和拍频的降低(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bah)。gydF4y2Ba

在本研究中，我们通过测量电生理学和收缩力的场势来测量和分析低温对hiPSC-CMs组织的影响，以了解机械生理学。心脏组织搏动率随温度的降低而降低。在电生理测量的情况下，钙的增加gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}和延迟KgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba电流与延长的FPD在降低温度反射。减少钠gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba电流随峰幅和峰斜率的减小而减小。收缩性测量表明，由于钙含量增加，跳动时间增加gydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}电流和延迟失活CagydF4y2Ba^{2 +gydF4y2Ba}通道。这项研究可以进一步帮助我们理解低温事件中的低温过程。gydF4y2Ba

支持本文结论的数据集包含在本文中。gydF4y2Ba

作者对国立研究财团的资助表示感谢。gydF4y2Ba

本研究得到了韩国政府(MSIT)资助的韩国国家研究基金(NRF) (No. 2017R1E1A1A01074550和No. 2020R1A5A8018367)的资助。gydF4y2Ba

作者和联系gydF4y2Ba

1. 全南大学机械工程学院，光州，61186，韩国gydF4y2Ba

   Pooja P. Kanade, Nomin-Erdene Oyunbaatar & Dong-Weon LeegydF4y2Ba

2. 全南大学下一代传感器研究与发展中心，光州，61186，韩国gydF4y2Ba

   Dong-Weon李gydF4y2Ba

3. 全南国立大学心血管疾病先进医疗器械研究中心，光州，61186，韩国gydF4y2Ba

   Dong-Weon李gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

PPK提出了概念，进行了实验，分析了实验结果，并起草了手稿。NEO对hiPSC-CMs进行细胞培养。DWL监督了这项研究并审阅了手稿。所有的作者都阅读并认可了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaDong-Weon李gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

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