利用末端脱氧核苷转移酶芯片上信号放大的病原基因微阵列检测方法

建立了一种基于芯片上信号放大的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)微阵列检测方法，以可视化致病基因。采用氧等离子体对用于微阵列的环烯烃共聚物(COC)基板进行了表面亲水性处理。用紫外照射将捕获的探针DNA固定在COC表面。捕获探针DNA的3ʹ端固定在COC表面，用磷酸基修饰以提供对TdT反应的抗性。因此，只有当捕获探针DNA获得靶基因，并在靶基因的3ʹ端连续添加生物素-11-脱氧尿苷三磷酸(b-dUTP)时才会触发TdT反应。随后，链霉亲和素结合金纳米粒子(s-AuNPs)通过生物素-链霉亲和素相互作用标记多尿苷尾。在s-AuNPs存在的情况下，用银增强法放大了视觉信号。通过对四种病原菌的分析和目视鉴定，证实了该检测方法的有效性。

因摄取受污染的水或食物而引致的食物中毒，在世界范围内是一个普遍存在的问题[1］．致病性微生物在食物中毒病例中所占比例很高，严重者可出现腹泻、呕吐、高热等症状，甚至死亡[2］．因此，准确、快速地检测病原微生物对提高公共卫生水平至关重要。传统的基于培养的微生物检测方法是劳动密集型和耗时的[3.］．虽然各种分子生物学检测方法，如酶联免疫吸附测定法、聚合酶链式反应(PCR)和原位杂交测定法已经发展起来，但微生物的同时诊断仍然具有挑战性[4］．为了克服这一局限性，有必要开发一种能够快速、灵敏、同时分析多种微生物的检测方法。

DNA微阵列是DNA排列并附着在固体表面或膜上的微观点的集合。该技术因其高通量和经济优势，被广泛应用于基因表达分析、基因分型、临床诊断、环境监测、食品安全检测等病原检测领域[5］．通过杂交反应，可以在阵列点上捕获检测样品中的致病基因，并将这种结合事件转化为荧光、发光或比色信号[6］．特别是，由于比色传感器阵列不需要昂贵的分析设备进行信号检测，因此它们具有比荧光传感器阵列更简单、更经济的优势[7］．基于各种材料的小型便携式微装置，如玻璃[8),文献[9),硅(10),聚二甲硅氧烷(11，12]、环烯烃共聚物(COCs) [13，14]，已进行了简化现场检测的研究。COCs具有高耐化学性、低吸水率和高光学透明度等优点，是制备微阵列芯片的理想底材[15，16，17，18］．它们是传统材料(如玻璃)的一个很好的替代品，因为制造微系统，如反应室和微流体通道，是容易和经济的。通过紫外线照射在未修饰的COC底物上固定聚(胸腺嘧啶)10-聚(胞嘧啶)10标记(TC标记)DNA寡核苷酸的方法，可以简单地制备低成本的DNA微阵列芯片[19］．尽管COC底物与DNA寡核苷酸结合机制的更具体原理尚未阐明，但固定在微阵列芯片上的TC标签DNA寡核苷酸即使在高温条件下(100°C, 20分钟)也表现出稳定的性能，其作为微阵列分析捕获探针的功能得到了确认[19，20.］．末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)是一种催化核苷酸以模板无关的方式加成到单链或双链DNA的3ʹ末端的酶[21］．TdT反应产物的序列取决于加入到反应中的三磷酸脱氧核苷酸池的组分。产生的长单链DNA结构使TdT成为生物分析的有力工具[22，23，24］．

在本研究中，我们使用COC衬底通过等离子体和紫外线处理的简单过程制备了DNA微阵列芯片。我们设计了一种利用片上信号放大技术和金纳米颗粒检测致病基因的视觉识别方法。研究了片上信号放大、比色信号形成和DNA微阵列制作的最佳条件。并以4种实际病原菌为检测靶点，验证了该检测方法的有效性。

化学药品和试剂

本研究中使用的所有合成DNA低聚物均购自Bioneer(韩国大田)，DNA低聚物的序列信息列于附加文件中1S1:表。COC芯片(长:75毫米×宽:25毫米×高:1.7毫米)是由MNTEK公司(水原，韩国)定制的。可连接的HybriWell室(6孔，长:9.8毫米×宽:20毫米×深:0.25毫米)从Grace Bio-Labs (OR, USA)购买。TdT和生物素-11-脱氧尿苷三磷酸(b-dUTP)从赛默飞世尔科学公司(立陶宛维尔纽斯)购买。多重PCR试剂盒购自Qiagen (Hilden, Germany)。Lambda外切酶购自New England Biolabs (MA, USA)。链霉亲和素结合金纳米颗粒(s-AuNP;10 nm)溶液购自Cytodiagnostics (Burlington, ON, Canada)。银增强套件和异丙醇购自Sigma-Aldrich (MO, USA)。无水乙醇(HPLC级)购自Fisher Scientific (NJ, USA)。 Micro Spotting Solution Plus (2×) was purchased from Arrayit Corporation (Sunnyvale, USA). Saline-sodium citrate buffer (20×, pH 7.0) was purchased from Rockland (ME, USA).

菌株和培养条件

O157: H7大肠杆菌(NCCP 11091)摘自《国家病原体文献集》(NCCP, Korea)。单核细胞增多性李斯特氏菌(KCTC 3569)来自韩国类型文化收藏馆(KCTC, Korea)。蜡样芽胞杆菌(写明ATCC 14579)和鼠伤寒沙门氏菌(ATCC 14028)来自美国类型文化收藏馆(ATCC, MD, USA)。四种病原体(O157: H7大肠杆菌，单核细胞增多性李斯特氏菌，蜡样芽胞杆菌,鼠伤寒沙门氏菌)在37°C的脑心灌注液培养基中培养12-16小时，并用紫外-可见光谱仪(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)在600 nm处测定培养细胞的光密度。然后将细胞在无菌水中稀释到10的浓度⁸细胞/mL，保存在−20°C直到使用。

DNA微阵列芯片的制备

定制的COC芯片在使用前依次在蒸馏水(DW)、乙醇和异丙醇中洗涤5分钟，然后使用气枪彻底干燥。随后，为了使COC芯片表面水化，将COC芯片暴露在30 W的氧等离子体(CUTE, Femto Science Inc.，韩国)中，流速为20 sccm，持续10 s。为了在COC芯片上获得均匀的微阵列斑点，研究了最佳斑点缓冲条件。为此，荧光探针DNA的5ʹ端被cy3修饰，3ʹTC标记(聚胸腺嘧啶10-聚胞嘧啶10)在标记溶液A (150 mM磷酸钠缓冲液，0.01% tween 20, pH 8.5)或B (1×微标记溶液+，Arrayit，美国)中稀释至最终浓度0.5 μ M。使用XactII微阵列(LabNEXT, USA)和直径500 μm的Xtend微阵列引脚进行斑点检测，然后在70%的湿度条件下干燥10分钟。阵列斑点暴露在254 nm的紫外光照下，功率为3 mW/cm²使用XL-1000 UV交联剂(Spectronics Corporation, NY, USA)进行30分钟。随后，为了去除未结合的DNA分子，COC芯片用洗涤缓冲液(0.1× SSC缓冲液，0.01% SDS, pH为7)洗涤10分钟，然后用DW漂洗。制备的微阵列芯片储存在湿度(52%)和温度(25°C)保持的室内使用，通常立即用于后续实验。阵列斑点的荧光图像由GenePix 4100微阵列扫描仪(Molecular Devices, CA, USA)获得。

TdT反应参数及s-AuNP浓度的优化

将100 μ M的阳性探针DNA以TC标记修饰的5ʹ端固定在COC芯片上，按相同的方法制备DNA微阵列芯片DNA微阵列芯片的制备部分。探讨最佳的负反应时间、25µL (TdT)反应的解决方案(1×负反应缓冲区,200µM b-dUTP,和60单位TdT)在反应室COC芯片是在37°C的环境为各种时间(0 - 4 h),然后在70°C灭活了20分钟。然后,25µL s-AuNP溶液的光学密度(OD) 0.3加载到阵列斑点和杂化在37°C 1 h。COC芯片被洗涤缓冲(0.1×SSC缓冲0.01% SDS,杂交反应前后pH值均为7)10 min。银增强反应用于增强阵列斑点的比色信号，在25°C下使用盖玻片进行4分钟，用DW冲洗后使用FastGene®GelPic LED Box (Nippon Genetics)成像。为了测量阵列点的比色信号，利用Image J软件将COC芯片图像转换为校正亮度和锐度的黑白反演图像。然后，利用Image J软件将阵列光斑中心的16个像素的强度表示为代表像素亮度的“灰度值”。“平均灰度值”表示从每个阵列点获得的灰度值的平均值。研究了不同浓度的b-dUTP (0-200 μ M)进行1 h的TdT反应，以确定最佳条件。不同浓度s-AuNP (0-0.5 OD)的分析方法与前次实验相同，TdT反应时间为1 h, b-dUTP浓度为120µM。

真实样本的定性分析

4对能够与每个致病基因特异杂交的引物被用于PCR(附加文件1:表S1)。PCR扩增在50µL的混合液中进行，每个引物对含有0.2µM, 10⁵使用T100热循环仪(Bio-Rad, CA, USA)检测目标病原体细胞和1× PCR主混合物(Qiagen, Hilden, Germany)。以下使用PCR程序:95°C,持续15分钟,35周期为30年代在95°C, 56°C 90年代,和72°C 1分钟。exonucleolytic消化、50µL的混合解决方案包含PCR产品最后1×λ缓冲和25个单位的λ核酸外切酶的核酸外切酶反应是在37°C孵化15分钟和10分钟灭活在75°C。这个解决方案是装上COC芯片的每个捕获探针DNA固定在中描述的一样DNA微阵列芯片的制备切片，37℃反应室孵育2 h，诱导靶基因与捕获探针DNA杂交。TdT反应液(25µL;1×负反应缓冲区,200µM b-dUTP 60单位TdT)在反应室COC芯片孵化在37°C 2 h,然后灭活20分钟的70°C。接下来,25µL s-AuNP解决方案(0.3 OD)加载到阵列斑点使用反应室和杂化在37°C 1 h,并使用封面幻灯片银增强反应是由25°C 4分钟。COC芯片被洗涤缓冲(0.1×SSC缓冲0.01% SDS,s-AuNP的TdT反应和杂交反应前后pH值均为7)10 min。最后，使用FastGene®GelPic LED Box (Nippon Genetics)对COC芯片进行成像，然后用DW冲洗并用气枪干燥。

基于微阵列的致病基因视觉识别分析设计

通过制备未修饰的co基微阵列芯片和优化比色信号形成，开发了一种基于微阵列的检测方法，利用末端核苷酸加成反应可视化识别致病基因。如图所示。1，所述捕获探针DNA可与靶基因部分互补结合，通过接触微阵列斑点仪一致排列并固定在COC芯片表面。将载于微阵列芯片上的靶基因与具有序列互补的捕获探针DNA杂交，通过TdT反应将b-dUTP连续添加到3ʹ端。合成的聚b-dUTP通过生物素-链霉亲和素相互作用与s-AuNPs形成络合物，形成黑点，通过额外的银增强反应4min，肉眼可以观察到黑点的形成。然而，在靶基因缺失的情况下，由于TdT不能使用3ʹ处的磷酸保护捕获探针作为反应底物，因此抑制了聚b-dUTP在阵列点上的合成。与一般的实时聚合酶链反应相比，这种基于微阵列的检测方法可以同时分析多个目标，在吸收波长不重叠的范围内使用荧光探针，节省了多目标或多样品分析所需的时间、成本和人工。此外，由于在微阵列斑点中形成的比色信号最大限度地减少了使用复杂和昂贵的设备进行信号分析，因此可以进行直观的结果分析，并且与基于荧光信号的微阵列检测方法相比具有成本效益。过去，为了检测靶基因，通常在比色微阵列芯片上使用简单直接结合靶DNA和AuNP探针的三明治试验[25，26］．另一方面，在我们的方法中，通过TdT反应从一个目标基因生成b-dUTP尾巴具有结合更多aunp到目标基因的优势。这些特性作为放大比色信号的因素。

DNA微阵列芯片制备点阵条件的优化

为了确保在未修饰的COC芯片表面形成均匀的微阵列斑点，在使用前用水、乙醇和异丙醇依次清洗，并用氧等离子体处理，以诱导COC表面的亲水性。为了使用接触微阵列系统生产高质量的DNA阵列斑点，微阵列引脚的拾取高度和速度分别被确定为1.5 mm和3 s(数据未显示)。为了防止样品之间的交叉污染，确定了5个循环DW洗涤30 s和风干30 s作为最佳洗涤条件(数据未显示)。研究了最佳点状缓冲条件，如图所示。2．比较了两种点阵方案。缓冲液A (150 mM磷酸钠缓冲液，0.01%渐变20)[19荧光探针DNA集中固定在光斑边缘，而商业缓冲B (Arrayit公司生产的1×微斑点溶液+)倾向于非均匀固定在光斑中心。由于捕获探针dna在微阵列斑点上的均匀分布对后续杂交和酶解反应的效率至关重要，我们进一步测试了缓冲液A和b的混合条件。我们发现，当两种缓冲液以1:1的体积比混合时，形成了均匀固定的斑点(图1)。2C).这种现象可能是受斑点缓冲液中表面活性剂浓度的影响。在以往的研究中，有报道称，当斑点缓冲液中表面活性剂的量较小时，微阵列的荧光信号集中在斑点中心，而当表面活性剂的量较大时，会出现咖啡环图案[19，27］．然而，在确定微阵列斑点的质量时，不仅是表面活性剂的浓度，还有其他因素，如固体基质的表面特性、溶液的粘度、干燥条件和微阵列类型，被认为在一个复杂的方式中起作用。

实验参数优化

为了优化TdT反应条件，确定了b-dUTP的最佳反应时间和浓度。TdT反应时间(0、0.5、1、2、4 h)下斑点灰度均值分别为48.37±28.16、101.49±26.33、164.35±34.42、183.06±26.88、177.3±26.32。确定最佳TdT反应时间为2小时。微阵列光斑灰度值随时间的增加而增大，在2h时呈现饱和趋势(图1)。3.A)。b-dUTP浓度(0、40、80、120、160、200 μ M)点的平均灰度值分别为20.91±1.17、35.16±9.28、61.72±17.82、121.34±8.46、93.99±25.53、110.19±30.29。因此，浓度为120 μ M时，灰色值最高，被认为是最优的(图1)。3.B).此外，还研究了产生比色信号所需的s-AuNP溶液的最佳浓度，确定0.3 OD为最佳浓度，如图所示。3.C. s-AuNP浓度(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 OD)点的灰度平均值分别为22.78±0.57、95.12±10.8、139.92±10.12、193.92±22.74、168.05±28.67、137.55±28.01。灰色值随着s-AuNP浓度的增加而降低的一个原因可能是由于s-AuNP之间的电斥力。在我们之前的研究中[28， s-AuNP的表面电荷被确定为- 24.8 mV，阵列点产生的生物素标记的聚尿苷尾巴也会被糖-磷酸骨架带负电荷。因此，过多的s-AuNP浓度条件会由于粒子间的电斥力增加而抑制s-AuNP与阵列点的结合效率。为了在阵列点形成最高的比色信号，将最佳条件简单设置为TdT反应时间2 h, b-dUTP浓度120 μ M, s-AuNP浓度0.3 OD。图中使用捕获的COC芯片上形成的阵列斑点图像进行表征。3.(附加文件1:图S2)。

所提方法的可用性

评价了该方法在实际致病基因分析中的适用性。首先，为了从4种微生物培养基中获得目标dsDNAs，使用4种靶向特异的正向引物和5ʹ磷酸基修饰的反向引物进行PCR。随后，PCR产物用lambda外切酶处理，这样只有ssdna能够与每个捕获探针DNA杂交1:图S3)。这些测试样本分别在每种病原体存在或不存在的情况下制备，并在一个COC芯片上进行分析，每个目标特异性捕获探针DNA固定在该芯片上。如图所示。4第一，很明显，微阵列斑点的比色信号在所有病原体的每个目标ssDNA存在时显著增强。另外，通过分析图得到的点的平均灰度值。4A通过Image J软件测得42.74±6.98大肠杆菌(0个细胞)，为180.31±20.38大肠杆菌(10⁵细胞)，60.97±7.66为李斯特菌(0细胞)，182.04±14.5李斯特菌(10⁵细胞)，66.28±14.16为芽孢杆菌(0细胞)，202.8±19.26芽孢杆菌(10⁵细胞)，57.42±6.31沙门氏菌(0个细胞)，187.44±26.29沙门氏菌(10⁵细胞(图)。4B).这些结果表明，目前的检测方法可以很容易地帮助人们用肉眼从多个病原体样本中识别出每种致病基因的存在与否。

总之，我们制作了COC底物DNA微阵列芯片，并开发了一种可视化识别致病基因的检测方法。通过氧等离子体和紫外处理制备了DNA微阵列芯片，并研究了最佳的DNA斑点缓冲条件。此外，还成功地确定了阵列光斑表面发生信号放大和比色反应的最佳条件。通过对四种病原菌样品的分析，验证了该检测方法的有效性，无需复杂的分析设备，即可直观地确认病原菌的存在。因此，通过本研究实现了一个能够同时检测多个基因的系统，并确定了其在精确检测病原体方面的应用。

本研究期间产生或分析的所有数据均包含在本文及其附加文件中。

b-dUTP:

生物素化的脱氧尿苷三磷酸

COC:

环烯烃共聚物

OD:

光密度

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

s-AuNP:

Streptavidin-conjugated黄金纳米颗粒

SDS:

十二烷基硫酸钠

SSC:

Saline-sodium柠檬酸

TdT):

末端转移酶

该研究得到了韩国食品研究所(KFRI)的主要研究项目的支持，由科学和信息通信技术部提供资金。

该研究得到了韩国食品研究所(KFRI)的主要研究项目的支持，由科学和信息通信技术部提供资金。

作者和联系

1. 韩国食品科学研究院食品安全流通研究组，全北完州郡伊尾面高山里703号，邮编55365

   金太勇，林敏哲，林正娥，崔成旭，吴敏阿

2. 全北大学食品科学技术系，全北全州市德津区百济大路567号，全北全北全州市，54896

   Tai-Yong金

贡献

TWK对实验方法的设计和大部分数据的采集做出了贡献。MCL和日航收集并分析了数据。SWC有助于解释实验结果。MAW提出了研究概念，并对稿件进行了严格的修改和批复。所有作者已阅读并认可最终稿。

相应的作者

对应到Min-Ah吸引．

伦理批准和同意参与

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

出版商的注意

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