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单粒子水平分析细胞外囊泡的方法

188博金宝官网登录体积10文章编号:14（2022）引用这篇文章

摘要

细胞外囊泡(EVs)是来自细胞的纳米大小的囊泡，通过生物流体在细胞之间运输生物材料。由于它们的生物作用和组成，它们被认为是潜在的药物载体和诊断应用。如今先进的纳米技术可以实现单粒子级的分析，这在过去是很困难的，因为它的尺寸小，低于衍射极限。单一EV分析揭示了EV的异质性，这是各种集成分析方法无法发现的。了解单个ev的特征可以进行更深入的病理和生物学研究。本文重点介绍了用于单粒子水平EV分析的先进技术，并介绍了每种技术的原理。

简介

细胞外囊泡(ev)是来自细胞的纳米大小的囊泡，通过生物流体在细胞之间运输生物材料[1］．自1978年在霍奇金病研究中发现ev以来，其生物学作用及其在给药和临床诊断方面的潜力一直备受关注[2，3.，4，5］．ev由磷脂、胆固醇、脂肪酸和膜蛋白组成。它们含有rna和dna等遗传信息，是与细胞分裂和生产力相关的生物载体。1a).由于这些生物学特性，它们被认为是潜在的药物载体和诊断应用[2，3.，6，7］．根据ev的大小和细胞来源(多泡体、质膜驱动、凋亡细胞)，ev可分为外泌体(50-200 nm)、微泡体(200-1000 nm)和凋亡小体(1-5 μm)。1b).采用多种方法将电动汽车从培养基中分离出来，研究其与生物角色的相关性。分离方法有几种，包括密度差(超离心、密度梯度超离心)、基于尺寸的分离(尺寸排除色谱、膜过滤)和基于化学亲和的分离(免疫亲和、聚合物沉淀)[8，9］．从各种类型的细胞和分离方法中获得的ev对于研究和生物应用的表征和鉴定至关重要。虽然目前还没有专门提出用于识别ev的特异性标记，但可以使用其膜蛋白标记(包括CD9、CD63、CD81、TSG101和Alix)对ev进行分析[10］．

图1
图1

一个细胞外囊泡及其组成的示意图。b细胞外囊泡的生物学起源及纳米结构的规模比较。c单一EV分析技术的测量能力。NTA纳米粒子的跟踪分析,nFCMnano-flow血细胞计数,TIRF全内反射荧光，DF暗视野,新兴市场电子显微镜,AFM原子力显微镜,石头剪刀电阻脉冲传感

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生物学分析，如western blots、聚合酶链式反应(PCR)和动态光散射(DLS)，根据细胞系和分离方法的不同，提供了具有显著不同成分的趋势。然而，通过EV群的集成分析，仅对其生物学和物理代表性进行了分析，不足以识别EV的生物物理和生化特性及其作用。分析技术的发展使得在单个粒子级别(而不是集合)使用分析来确定ev的作用成为可能[11，12，13］．单EV分析技术是通过解决EV纳米尺度尺寸、生物化学络合物、EV异质性和测量精度等挑战性问题而发展起来的。目前发展起来的单个EV分析技术大多是在单个粒子水平上分析EV的物理和生化特性。为高效分析单个电动汽车而开发的技术主要分为光学技术和非光学技术(图5)。1c)。

光学分析是一种利用光获取信息的技术。然而，由于ev的体积小，接近衍射极限，传统光学显微镜很难直接观察到。因此，利用跟踪粒子扩散散射光信号的纳米粒子跟踪分析(NTA)和利用单个粒子散射光模式的流式细胞术(FCM)，对亚波长尺度的散射光信号进行分析，获得物理信息。此外，荧光技术利用光和分子的相互作用来标记和观察与荧光团结合的目标标记。利用荧光技术，可以通过尺寸低于衍射极限的单个ev的选择信号获得ev的大小和位置等信息。非光学技术在信号测量中不能直接探测到光子。电子显微镜(EM)技术检测散射或传输的电子，电阻脉冲传感(RPS)技术测量电子电压通过孔隙引起的电阻变化。原子力显微镜(AFM)技术检测尖端的变形和测量膜的机械性能和形状。通过这些不同的纳米技术，可以分析和交叉验证单个电动汽车的异质特性和生物功能[10］．本文综述了一种亚衍射极限尺度下的单一EV分析技术。

光学技术

直接观测电动汽车是获取电动汽车信息最直接的方法之一。一般来说，光学显微镜是用可见光范围内的波长来探测物体的。不幸的是，由于1873年恩斯特·阿贝(Ernst Abbe)发现可见光的衍射极限，亚波长尺度上的ev在通过光学显微镜直接观察时受到了限制[14］．

$ $ d = \压裂{\λ}{2 na} = \压裂{\λ}{2 n \ cdot罪\θ}$ $
(1）

在上式中，d为阿贝衍射极限，表示区分两点的最小分辨率。数值孔径(NA)等于折射率的正弦值n乘以入射角θ．单粒子EV分析的基本目的是通过单个粒子在次衍射极限范围内的选择性或有限信号来获取其信息。

$ $我\ propto \压裂{{d} ^{6}}{{\λ}^{4}}{\离开(\压裂{{n} ^ {2} 1} {{n} ^{2} + 2} \右)}^ {2}$ $
（2）

在瑞利散射中，是强度我是否与粒子直径的六次方成正比d与波长的四次方成反比λ（n为EV与介质的折射率比)。散射光成像可以探测到大于50 nm左右的粒子，而蛋白质、抗体等小于ev的粒子的散射光则很难被探测到[15］．

FCM是一种基于信号的分析技术，它使用光电倍增管(PMT)或光纤从不同角度检测单个粒子发射或散射的光子。基于图像的单粒子分析，包括NTA和其他几种显微镜技术，根据光信号强度和粒子发射的位置信息分析信息。单ev在没有特定标记的散射光下进行分析，或用蛋白质、基因和膜染料(如DiI或DiO偶联荧光团)进行标记。单粒子发出的光信号以点扩散函数(PSF)的形式表示。在各种算法中，最常见的方法是将高斯分布拟合到用PSF表示的单个发射极信号[16］．通过拟合高斯分布的坐标逼近单个粒子的位置，以确定粒子的位置[17，18］．这些数据过程是单粒子光学分析的重要组成部分[19］．

纳米粒子跟踪分析(NTA)

NTA是一种多功能的技术，能够通过选择性荧光标记分析生物标志物的浓度、大小和亚种群。与DLS相似，NTA通过漂浮在介质中的布朗运动来估计电动汽车的大小。然而，这两种技术在分析方法方面有所不同。NTA是一种自下而上的方法，它跟踪单个粒子的扩散率，并将单个粒子的数据推广到整个组，而DLS是一种自上而下的集合分析方法，观察整个粒子的波动信号并分析自相关函数。

在NTA中，根据每一帧的时间间隔检测单个粒子的散射信号，然后通过最近邻算法将信号链接起来[20.］．粒子的布朗运动由均方位移(MSD)计算，单ev的直径由Stokes-Einstein方程估计(图1)。2一个)。

图2
图2

独立电动汽车光学分析系统原理。一个纳米粒子跟踪分析(NTA):通过对单个粒子的布朗运动进行数帧跟踪，根据均方位移(MSD)预测粒子直径。b纳米流式细胞术(nFCM):通过测量被鞘状流聚焦的单个颗粒在流动中的前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)光的强度来估计颗粒的大小

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$ $ D = \压裂{{K} _ {B} T} {f} = \压裂{{K} _ {B} T}{3 \π\埃塔D} $ $
（3）
$ $ - = \眉题{{x, y \ \ langle捕杀}^{2}}= \压裂{4 {K} _ {B} Tt}{3 \π\埃塔d} $ $
（4）

在哪里D为球形粒子的扩散系数，KB是玻尔兹曼常数，和T是热力学温度。在斯托克斯定律,f阻力系数是否应用于直径为的球形粒子d在粘性介质中η［21，22，23，24］．

动态单辆电动汽车的跟踪分析依赖于获取的图像。因此，提高跟踪精度最重要的因素是获得一个清晰的高信噪比粒子信号。EV在瑞利散射区散射光，其强度与直径的六次方成正比。15］．NTA的粒径范围为50 nm ~ 1 μm。为了精确成像和分析，需要以相对均匀和适当的尺寸制备，以避免由于大颗粒或聚集颗粒的散射光异常强烈而受到其他信号的干扰。此外，浓度过高的样本会导致检测到的粒子与周围的其他粒子信号错误连接，并对需要在多帧中连接粒子的跟踪分析提出挑战[7，25］．为了获得高信噪比，商用NTA技术对入射光束使用高倾斜薄照明(HILO)，以最小化激光厚度和聚焦深度(DOF)之间的差异，并降低失焦噪声[15，26］．

当仅依靠散射光信号时，ev和其他类似大小的纳米颗粒，如纳米气泡和蛋白质聚合体，是无法区分的。为此，正在开发NTA与荧光标记方法相结合的方法。据报道，一种荧光- nta (fl-NTA)技术可以用含有DiO、DiI和PKH染料的膜标记染料对ev进行标记，从而专门区分由磷脂组成的囊泡[18，26，27］．此外，定量分析特定目标EV标记是可能的，如蛋白质或核酸与各种荧光团结合[Alexa Fluor, CF染料，量子点(Qdot)等][18，27，28，29，30.］．Dragovic等人从胎盘来源的合胞滋养细胞ev中分离出合胞滋养细胞外泌体和微囊泡，并通过fll - nta分析了qdot共轭抗plap抗体染色的ev。据报告，每个群体都被有效隔离。最近，Cho等人引入了一种具有不同波长时间顺序照明的多fl- nta，通过对CD9、CD63和CD81等特定蛋白质标记物的荧光标记，可以同时分析三种蛋白质的亚群[31］．荧光标记是一种有用的工具，以区分电动汽车与其他颗粒和杂质。然而，由于其结构特性，用于染色电动汽车的亲脂染料可以形成胶束或聚集体。由于这些粒子很难从物理上与ev区分开来，所以在标记ev之前必须检查纯染料信号[28，32，33］．

Nano-flow血细胞计数(nFCM)

FCM是一种单颗粒分析技术，通过微通道中的鞘状流来测量排列在中心流中的颗粒。2b).通过测量荧光信号和散射光信号的两个方向，即前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)，可以实现单粒子分析(图)。2b) (34］．传统的流式细胞术(FCM)是一种测量数微米颗粒的大小、浓度和表型的有用技术，具有较高的准确性和可重复性。然而，该技术在纳米级电动汽车上的应用有限。nFCM通过技术优化解决了传统FCM在纳米尺度分析上的局限性[35，36，37］．

通过高性能PMT、低压和优化的鞘流，使用高分辨率流式细胞仪对纳米电动汽车进行定量和定性分析是可能的[38］．低护套率降低的流量增加了ev的暴露时间，能够对直径约50 nm的粒子进行精确的信号检测和测量[35，38，39］．此外，为了探测次衍射极限缩放粒子的FSC和SSC，需要两个探测器之间的角差约为15º至150º(而典型的FCM跨度为0.5º至15º)[36，40，41］．

当高浓度的粒子悬浮在鞘液中时，单个粒子的信号会重叠，产生蜂群效应，导致巧合检测。保证定量分析精度的颗粒浓度必须在10左右7到109颗粒1毫升[42］．当单个电动汽车的散射光和荧光信号在适当浓度的稀释中保持恒定时，就可以进行准确的标记识别和亚群体分析[43，44］．闫晓梅组在实验室自制的高灵敏度流式细胞仪(HSFCM)通过优化激光功率和停留时间，实现了数纳米粒子分析[39］．与NTA类似，荧光标记可以区分nFCM中的ev和杂质。通过用荧光膜联蛋白V标记暴露于磷脂酰丝氨酸的EV，可以比仅使用散射信号检测到更特异性的EV群体[45］．Tian等人使用HSFCM对表达CD9、CD63和CD81的ev进行染色，并同时比较这两种标记的亚人群。此外，在一项研究中，我们对结直肠癌标志物CD147进行荧光染色，以比较患者组和健康供体在EVs中的表达率差异[35］．Morales-Kastresana等人使用nFCM分析了基于脂质、蛋白质和rna的EV染色方法，发现即使在没有EV的情况下，两亲性染料或SYTO RNASelect也能形成胶束或聚集染料[43］．这表明，如前所述，在使用标记进行EV分析之前，有必要测量荧光标记或碱基缓冲的背景信号中的染料聚集量作为对照。

全内反射荧光显微镜(TIRF)和暗场显微镜(DF)

TIRF显微镜是一种光学技术，能够对单个电动汽车的生物复杂性进行高分辨率和直观的分析，无需额外的数据分析[46］．全内反射穿透的薄的瞬变场区域使近表面的EV分析成为可能。在倏逝场中，透射能量随到表面的距离呈指数级衰减。当它与初始透射强度相比约为1/e时，称为穿透深度。

$ $ d = \压裂{\λ}{4 \π\√6 {{{n} _ {1} \ cdot罪}^{2}\θ- {n} _ {2}}} $ $
（5）

在上式中，d为渗透深度，λ入射光的波长，和θ是入射角。n1而且n2是玻璃和介质的折射率。一般侵彻深度在100 - 300nm左右。因此，只能检测到选择性激发的荧光标记ev，从而实现高信噪比成像。因此，光片不会激发失焦信号，从而降低了背景噪声(图5)。3.a).此外，TIRF显微镜对样品的光损伤比外荧光显微镜小。

图3
图3

光学显微镜技术原理。一个全内反射荧光(TIRF)显微镜下单个EV分析类型:细胞内EV通路跟踪，固定化EV表型分析。b两种TIRF显微镜(左:棱镜型TIRF，右:物镜型TIRF)。c暗场显微镜检测粒子散射射线的原理:被粒子散射的信号显示得很亮，而透射的信号没有被检测到，导致背景变暗

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TIRF显微镜通常分为两种类型:棱镜型和物镜型。3.b).在棱镜型中，光源通过棱镜入射，散射噪声低，样品类型和位置的可扩展性高。在物镜类型中，使用一个具有高NA的物镜，样品必须位于焦点区域内。高na目标可通过近场成像获取高分辨率图像[47］．

尽管TIRF显微镜的被照射区域是现有光学技术所能达到的最薄的光片，但它仅限于近表面的分析。因此，悬浮中的纳米颗粒要么被固定，要么通过表面的微通道来限制它们的行为。表面固定化电动汽车的成像是分析单个电动汽车的常规方法[48，49］．Han等人使用亲和素-生物素络合物将单个EV固定在二甲基二氯硅烷修饰的玻璃表面，并根据EV分离方法分析膜蛋白亚群[48］．同样，还报道了一种间接测量用亲和素-生物素复合物固定在封面底部的荧光标记脂质体大小的方法[50］．然而，细胞衍生的囊泡是由异质膜成分组成的，仅通过染色脂质、蛋白质等特定成分，从荧光信号估计ev的大小可能存在误差[32，33］．

在消失场区，只能观察到细胞膜上的单分子层和与活细胞底物接触的细胞器的信号。单个ev与细胞内细胞器相互作用的通路分析，或通过检测标记ev来追踪细胞膜[51，52］．由于全内反射对介质的折射率很敏感，因此必须注意细胞间环境的复杂和非均匀折射率[53，54］．Hoshino等人通过定位invendordia actin和EV标记，如CD63和Rab27a，揭示了EV与细胞invendordia之间的关系[55］．

他等人分析了用Mg荧光标记的外泌体2 +-依赖的DNAzyme，使用微流体通道。他们通过单粒子水平的荧光强度量化了miRNAs [56］．此外，目前正在开发使用TIRF显微镜分析沿微通道流动的单个ev亚群的方法[57］．

非衍射光直接穿过背景不能通过镜头，他们的信号丢失和变暗。同时，被物体散射的衍射射线通过透镜，其信号被采集为明亮的图像(图1)。3.c).研究了用于测量纳米金属颗粒瑞利散射的DF显微镜，并结合各种光学技术应用于单个EV分析[58，59，60，61］．DF显微镜的优点是它可以光学观察ev而不需要标记它们[60］．

一般情况下，DF显微镜与TIRF相结合，获得分辨率为30 ~ 40 nm的散射信号[62］．使用带穿孔镜的棱镜或物镜型TIRF成像散射信号[63］．Akagi等使用激光照明暗场显微镜和片上微毛细管电泳测量单个ev的ζ电位[64］．他们测量了单个ev的散射光信号和粒子的迁移，以确定zeta电位和前列腺癌细胞来源ev的去酰化之间的关系，而没有标记。作者报告说，癌细胞衍生的ev含有更多的唾液酸和更大的负电荷[64］．

为了技术

电子显微镜(EM)

电磁是求解EV分析光学衍射极限的代表性技术。加速的电子束在样品上散射或透射，成像的分辨率可达几纳米。通过德布罗意关系计算加速度电压与电子波长之间的关系，可以预测电磁的分辨率。

$ $ \λ= \压裂{h} {mv} = \压裂{h}{\√6 {2 m E {} _ {k}}} $ $
(6）
$ $ {E} _ {k} = eV = \压裂{1}{2}m v {} ^ {2} $ $
(7）

在德布罗意关系式中，波长λ和普朗克常数成正比h与电子动量成反比，Ek电子的动能是否乘以电子电荷e和加速电压V，和m和v分别是电子的质量和速度。电子的波长和速度可以通过电子的加速电压来控制。因此，加速电压越大，电子越接近光速，其波长就越短。电磁在理论上可以有几皮米的分辨率。然而，在现实中，由于不完善的电子镜头和成像环境，它的分辨率约为1纳米。然而，由于电子的波长较短，我们有可能以光学显微镜无法达到的分辨率分析ev的形状[65，66］．

利用接收到的电子信号来确定样品状态的方法主要分为扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)。扫描电镜是一种从聚焦的电子束照射样品中检测背向散射电子(BSE)或二次电子(SE)，并通过数据处理对其进行重构的技术。4a).使用扫描电镜观察电动汽车，电动汽车是不导电的，必须在电动汽车表面覆盖一层金属薄膜，以分散电子[67］．一般来说，扫描电镜是观察电动汽车外观的一种有效方法。然而，ev的外部形状在附着于表面时发生了变形，难以区分不同的粒子。金属涂层也使得很难观察磷脂双分子层的内部。

图4
图4

三种电子显微镜(EM)技术。一个扫描电子显微镜(SEM)可以检测金属膜沉积的电液的背散射电子(BSE)或二次电子(SE)信号。b透射电子显微镜(TEM)是根据电子透射率来检测通过重金属负染ev的电子，从而获得图像。c低温瞬变电磁法的原理与瞬变电磁法相似，但它是通过冻结ev来快速固定ev，使其保持自然的球形

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相比之下，TEM可以利用宽电子束对EV内部进行高分辨率的观察(图1)。4b).用透射电镜观察ev时，将固定在支撑样品的网格上的外泌体用重金属进行负染。根据重金属涂层的数量，电动汽车可以区分为明亮区域和不传输电子的外围黑暗区域。在TEM成像中，在将样品吸附到网格上的阶段，脱水的ev并不能保持完整的球形，而看起来像一个杯子的形状。

脱水ev在形态分析方面存在局限性，采用低温透射电镜观察其自然形态(图1)。4c) (47］．低温透射电镜有利于分析纯体液中的ev，无需脱水、染色或化学固定，是观察ev自然状态下的球形形状的极好技术[1］．在低温tem成像中，小液滴内的ev被沉积在网格上，用乙烷(低温剂)快速冷冻(约180℃)以供观察。在速冻液体薄膜内的电动汽车处于天然的冷冻水合状态，通过传输的电子信号看起来像一个没有变形的球形[68］．低温透射电镜的分辨率约为2纳米，可以可视化磷脂双分子层，因此可以通过成像来区分囊泡和其他杂质[69，70，71］．

免疫-EM方法使用与金纳米颗粒结合的抗体，用特异性标记对ev进行负染色，使传统的EM不仅可以观察形态，还可以观察生物表型。金颗粒不传输电子，因此表现为暗相，因此可以识别蛋白质标记物的存在和位置。Kim等人利用免疫- em技术报道了抗程序性细胞死亡蛋白配体-1 (PD-L1)在肺癌细胞源性ev的外膜上表达[72］．除了观察电动汽车的二维(2D)图像外，还有一种对其三维(3D)结构进行体积观察的技术。通过连续切片块面扫描电子显微镜(SBEM)和聚焦离子束扫描电镜(FIB-SEM)分析EV的3D形状，该方法直接通过超显微组或聚焦镓离子束，以约15 nm的间隔切割EV固定块[70，73，74］．通过计算机程序，将物理切割的电动汽车体积重建为3D形状，从而实现对电动汽车内外的复杂形状分析[75，76］．

原子力显微镜(AFM)

AFM是一种扫描探针显微镜。在非光学分析方法中，AFM和TEM是分析非导电生物制品的首选方法。5a).通过静电相互作用固定在云母衬底圆盘上的ev被放置在金属夹具上，并通过尖端扫描它们的外部形状(图1)。5b).攻丝模式使用振动悬臂，同时扫描样品，通过激光和光电二极管检测膜挠度，获得三维形状信息和力学性能，如刚度、弯曲模量、附着力(图5)。5c) (77，78，79，80］．除电动汽车外附着在表面的碎片或盐在AFM成像中充当噪声，分析前需要充分清洗，未去除的杂质(~ 3 nm)可通过z轴基于尺寸的阈值分割与电动汽车区分[81］．

图5
图5

原子力显微镜(AFM)示意图。一个AFM信号检测原理。bAFM的接触方式可获得电动汽车表面的地形数据。cAFM的攻丝方式检测EV膜的变形，通过针尖施加力获得刚性和附着力等力学性能

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蛋白质之间的结合力可以通过应用于尖端的力来分析。通过分析EV的变形特性和力学稳定性，可以测量EV膜或通过尖尖的化学结合力等力学性能，这对于理解EV的药物递送和细胞与颗粒之间的相互作用至关重要[65，82］．Sharma等人证实，EV膜的变形随着施加在顶端的力的增加而增加，使中心凹陷更加明显。用与金珠结合的抗体测定免疫染色膜蛋白的物理性质。通过CD63的单抗原-抗体复键断裂分析膜蛋白的结合力及其在表面的存在[65］．

此外，利用三维原子力显微镜的力映射模式，可以对电动汽车的纳米力学性能进行分析。Yurtsever等人测量了转移性肿瘤细胞(143B)和非转移性细胞来源的外泌体的杨氏模量在~ 50 ~ 350 MPa范围内。高侵袭性转移性143B细胞源性外泌体(约192兆帕)的膜硬度高于非转移性细胞源性外泌体(约118兆帕)[82］．这种弹性的差异是由于细胞来源的外泌体根据转移不同的膜蛋白成分的差异，即使在同一细胞系中，蛋白质分析证实更多弹性纤维相关蛋白在外泌体中表达。脂质成分和膜蛋白的组成与膜的硬度有关，这与各种报道的结果一致[83，84，85，86，87］．

Ridolfi等人介绍了一种基于AFM图像数据通过静电相互作用来区分附着在衬底上的纳米泡和非泡物体的技术。利用附着变形的囊泡的高度、囊泡表面的接触角和表面投影半径来预测球形颗粒的直径。作者报告说，不同来源的ev具有非常相似的接触角，根据接触角值可以对ev和杂质进行分类。物理特征分析不能比力光谱(FS)更精确，但据报道，基于成像的分析有一定的可预测性[79］．Calò等根据磷脂和蛋白质的组成，使用FS计算各种纳米囊泡的杨氏模量。他们比较了三种囊泡的杨氏模量:合成脂质体、天然囊泡和病毒压缩的蛋白质外壳，表明膜蛋白的存在在增强膜硬度和赋予机械稳定性方面起着作用[88］．

电阻脉冲传感(RPS)

RPS检测通过电极的水溶液中非导电生物分子引起的电变化[7，89，90］．它已被广泛应用于单个粒子的特性研究，具有较高的精度和准确性[91，92，93］．RPS的结构包括两个室和电极，在多孔板的基础上划分。孔隙两侧的电位差产生电流，当低导电性颗粒通过孔隙时，此时的电阻增大(图1)。6a).电阻的增加减小了电流信号，通过孔隙的颗粒大小和zeta电位可以通过减小的电流强度和持续时间来测量。此外，可以通过测量颗粒在单位时间内通过孔隙的电阻脉冲数来分析纳米颗粒的浓度。在圆柱形模型中，球形颗粒通过圆柱形孔隙时阻力的相对变化为:

图6
图6

电阻脉冲传感(RPS)原理图。一个RPS测量原理及通过孔隙的颗粒信号。b利用RPS技术根据孔隙形貌获得信号剖面

全尺寸图像
$ $ \压裂{\δR} {R} \ sim \压裂{{d} ^ {3}} {{d} ^ {2} L} $ $
（8）

左项表示相对电阻变化，ΔR阻力变化和R是填充孔隙的介质的阻力。d粒子的直径和D而且l分别表示孔隙的直径和长度[94］．粒子通过扩散和压力驱动通量、取决于粒子的zeta势的电泳力和介质的电渗透力移动[94］．实际的阻力变化取决于通过孔隙的颗粒的性质、颗粒对周围介质的占用程度以及孔隙的几何多样性(图1)。6b) (91，95，96］．

可调谐RPS (TRPS)是一种先进的RPS技术，通过控制孔隙大小，提高了测量纳米颗粒(如ev)大小和浓度的准确性[90，95］．为了精确测量外泌体，需要优化孔径和电压等变量，并通过表面活性剂防止颗粒团聚，从而能够分析直径约37 nm的颗粒[92］．TRPS可以区分不同大小的多分散样品，比各种光学技术能够定量分析水溶液中的许多颗粒的分辨率更高。与NTA、DLS和nFCM等基于光学的分析技术相比，四种尺寸的单模态和多模态样品的尺寸分辨率以及每种尺寸的浓度测量具有很高的精度[97］．

结论

ev是体内纳米载体，作为细胞间通信和肿瘤进展介质。自首次发现以来，ev因其在给药和临床诊断方面的潜力而特别受到关注[2，3.，4，5，98］．电动汽车不仅有不同的成分，取决于细胞系，而且在来自同一细胞系的电动汽车群体中具有异质特征。考虑到它们服务的各种目的，它们在本质上是复杂的。因此，有必要对这些异构电动汽车进行区分，并揭示其作用。

通过技术的进步，解决了可见光衍射极限造成的光学测量困难和传统EM对生物颗粒分析的困难，十多年来对单个纳米颗粒的分析已成为可能。通过这些技术的进步，解决了免疫印迹法、酶联免疫吸附法、聚合酶链式反应等ev综合分析方法的局限性。在细胞外囊泡(MISEV)研究最小信息指南中，建议在单个囊泡的研究中，必须进行至少两种或两种以上的单颗粒分析，如形态学和生物学特性。因此，有必要通过反映快速发展的分析技术的多样性，以各种方式对电动汽车进行严格的分析。研究人员必须选择适合分析目的的技术1） ［10］．综上所述，单个EV的合适组合分析是了解EV生理病理特征、研究EV给药和诊断生物标志物的必经之路。

表1单一EV分析技术的比较
全尺寸表

数据和材料的可用性

不适用。

缩写

AFM:

原子力显微镜

疯牛病:

背散射电子

DF显微镜:

暗视野显微镜

景深:

景深

DLS:

动态光散射

新兴市场:

电子Microscop

电动汽车:

细胞外囊泡

FCM:

流式细胞术

fl-NTA:

Fluorescence-NTA

FIB-SEM:

聚焦离子束扫描电镜

FS:

力光谱学

FSC:

Forward-scattered光

帕克:

高斜度薄照明

默沙东公司:

平均平方位移

MISEV:

细胞外囊泡研究的最小信息

nFCM:

Nano-flow血细胞计数

NTA:

纳米粒子跟踪分析

拿拿淋:

数值孔径

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

PMT:

光电倍增管

PSF:

点扩散函数

PD-L1:

程序性细胞死亡蛋白配体-1

Qdot:

量子点

数:

电阻脉冲传感

扫描电镜:

扫描电子显微镜

SE:

二次电子

SBEM:

连续切片块面扫描电子显微镜

SSC:

侧面散射光

信噪比:

信噪比

3 d:

三维

TIRF显微镜:

全内反射荧光显微镜

透射电镜:

透射电子显微镜法

2 d:

二维

参考文献

  1. Raposo G, Stoorvogel W(2013)细胞外泡:外泌体，微泡，和朋友。细胞生物学杂志(4):373-383。https://doi.org/10.1083/jcb.201211138

    文章谷歌学者

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下载参考

确认

来自韩国医疗器械发展基金的财政支持，韩国首尔非常感谢。

资金

本研究得到了韩国政府(科学信息通信部、产业通商资源部、保健福利部、食品医药品安全处)提供的“韩国医疗器械开发基金”(批准号:no. 1)的支持。1711137918, rs - 2020 - kd000018)。

作者信息

作者和联系

  1. 浦项科技大学机械工程系，韩国庆北浦项37673

    Kwon Yongmin & Park jae - ung

  2. 浦项科技大学跨学科生物科学与生物工程学院，韩国庆北浦项37673

    Jaesung公园

作者
  1. Yongmin Kwon
    看来作者出版物

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  2. Jaesung公园
    看来作者出版物

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贡献

YM调查了以前的作品并撰写了手稿。JP为手稿提供了建议。两位作者都阅读并批准了最终稿。

相应的作者

对应到Jaesung公园．

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作者声明他们没有竞争利益。

额外的信息

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Kwon Y.， Park, J.单粒子水平分析细胞外囊泡的方法。微纳系统莱特1014(2022)。https://doi.org/10.1186/s40486-022-00156-5

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关键字

  • 细胞外囊泡
  • 单粒子分析
  • 纳米粒子跟踪分析
  • Nano-flow血细胞计数
  • 全内反射荧光显微镜
  • 暗视野显微镜
  • 电子显微镜
  • 原子力显微镜
  • 电阻脉冲传感
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