已使用灵活的3D神经电极记录来自周围神经的感觉信号

为克服肌肉假体的局限性，神经假体的感觉反馈研究近年来有报道。为了开发这样的假体，束内电极(一种末梢神经界面)主要用于连接神经系统和外部系统。通过这些电极，感觉反馈诱导患者的感觉是可能的。为了唤起自然的感觉，神经信号的精确记录应该先于感觉反馈，以便识别神经中感觉信号的模式，并在刺激神经时模仿这些模式。为此，我们此前开发了基于pdms的柔性穿透微电极阵列(FPMA)。在目前的研究中，我们验证了FPMA记录感觉神经信号的能力。植入兔坐骨神经的FPMA能够记录自发神经信号，记录的信号被分离成动作电位单位。此外，与踝关节运动同步的感觉神经信号被成功记录，证明FPMA是一个有用的外周神经接口，能够记录高分辨率的感觉信号。

为了恢复被截肢者的运动能力，已经开发了几种基于肌肉的假肢[1，2，3.］．然而，这些假肢有其局限性，难以控制精细运动，不可能有自然的感觉反馈[2，4，5］．为了克服这些限制，基于神经的能够直接与神经相互作用的假体已经出现[6，7］．外周神经接口广泛应用于这种基于神经的假肢研究[7，8，9］．在各类外周神经界面中，由于记录分辨率高、刺激选择性高，大部分基于神经的感觉反馈假肢研究都采用了束内电极[7，8，10］．

然而，对感觉反馈的研究依赖于简单的非特异性神经刺激策略。因此，所唤起的感觉并不十分自然，与现实生活中所经历的自然感觉有很大的差别[8，10］．这是因为简单的神经刺激不能很好地模拟神经中编码的感觉信号的复杂性[11］．为了产生自然的感觉，有必要识别通过神经的特定感觉信号以及它们的编码频率。之后，外周神经接口必须根据感觉信号的特定模式在感觉信号经过的确切位置刺激神经。因此，为了诱导自然感觉，周围神经界面需要具有准确记录感觉诱发神经信号的能力[11］．然而，目前使用的筋膜内电极大多专注于刺激，因此其记录周围神经信号的能力没有得到充分验证[7，10，12］．

在几种筋膜内电极中，犹他州倾斜电极阵列(USEA)是唯一一种具有神经刺激和神经记录能力的电极[8，13］．然而，USEA是刚性和不灵活性的，因为它是基于硅制造的。因此，USEA在应用于曲率较大的周围神经时存在局限性。此外，由于它的硬度，其物理性质与周围神经组织的不匹配严重，导致强烈的免疫反应[14，15］．因此，需要开发一种周围神经界面，它具有适应周围神经弯曲的灵活性，并具有柔软的特性，以减少免疫反应。

我们此前通过mesm技术开发了基于聚二甲基硅氧烷(PDMS)的柔性穿透微电极阵列(FPMA) [16］．因为FPMA是基于灵活的PDMS而不是硅，它可以灵活地适应神经的形状并降低免疫反应[17］．在这里，我们研究了FPMA记录周围神经信号对各种刺激的反应的能力。

末梢神经信号记录系统的研制

将FPMA与互连电缆集成在一起，制作了外围神经信号记录系统。

如前所述，FPMA是具有基于pdms的柔性衬底的针形电极阵列[16，17］．每个电极都被用作探针来感知周围电势的变化，因此高掺杂的硅被用作导体材料。首先，分别以50 nm/200 nm的厚度对Ti/Au进行溅射和制模(SRN-110, Sorona Inc.， Anseong, Korea)。采用阵列模式(LPX PEGASUS, SPTS技术有限公司，Newport, UK)对硅片进行深度200 μm的反应离子蚀刻，除了溅射部分(图1)。1a).我们用PDMS盖子覆盖溅射的Au垫片，以防止在接下来的制造步骤中进一步污染。为了建立FPMA的柔性基底，在蚀刻沟槽中填充液态PDMS，并在60℃下固化2 h(图1)。1b).去除PDMS盖后，通过切丁工艺制作正方形柱状阵列(图。1c).采用HNA溶液进行湿法蚀刻制备针状电极。在电极尖端用50 nm/200nm厚度的Ti/Pt溅射，以降低活性电极部位的阻抗(图1)。1d).除au溅射焊片和电极尖端外，采用低压化学气相沉积工艺沉积了厚度为3 μm的对二甲苯- c，采用对二甲苯涂层体系进行绝缘(NRPC-500, Nuritech，高阳，韩国)(图1)。1e)。

接下来，我们制作了一个定制的互连电缆用于已实验。互连电缆由对二甲苯c电缆、定制设计的柔性印刷电路板(fpcb)和超薄电线组成。采用对聚丙烯与金属层叠加的方法制备了对聚丙烯基电缆。第一层对二甲苯- c沉积在钛溅射硅片上约3 μm。我们溅射了厚度分别为50 nm/200nm的Ti/Au，并绘制了导电线。第二层对二甲苯- c涂覆在约3 μm处，使导电线绝缘。用反应离子蚀刻(RIE)蚀刻对二甲苯- c进行蚀刻，以打开连接垫并勾勒电缆轮廓。将硅片浸入钛腐蚀剂(氢氟酸溶液)中，制备了对苯丙基电缆。使用导电环氧树脂(Duralco 125, Cotronics, New York, NY, US)将基于对二甲苯的电缆连接到用作适配器板的fpcb上，并焊接电线以连接fpcb。防止有毒反应已，我们封装焊接部分完全使用PDMS。

制作的电极被切割成阵列的大小，并使用导电环氧树脂与聚丙烯基电缆集成。PDMS填充电缆与FPMA之间形成的间隙，以保证机械和电气稳定性，并在60℃下固化2 h(图1)。1f).将具有良好生物相容性的2 μm厚的聚苯乙烯- c包覆在集成神经界面上植入已．在这一步，用聚乙二醇(PEG)保护电极的尖端(图。1g).去除PEG并清洗活性电极部位，我们可以得到完整的外周神经接口装置(图1)。1h)。

外科手术

所有用于动物实验的外科手术都得到了DGIST动物保护与使用委员会(IACUC)的批准(批准号:dgist - iacuc - 22022502 - 0003)。该FPMA被植入到一只体重超过4公斤、一岁以上的新西兰白兔(NZW)的坐骨神经上，但它是根据体重而不是年龄选择的。为防止感染，术前用过氧化氢对FPMA和记录设备进行消毒。先用氯胺酮/羟嗪麻醉，麻醉时气管插管。使用2.5%异氟醚维持麻醉。腿上的毛在手术前被刮掉了。切开股二头肌(BF)和股直肌(RF)，露出坐骨神经。为了稳定地将FPMA植入坐骨神经，RF和阔筋膜张肌(TF)被另外分开。然后将FPMA通过BF和RF肌肉放置在神经附近。 The wires attached to the FPMA came out through the space between the RF and TF muscles and were connected to the printed circuit board (PCB) (Fig.2a).将FPMA小心放置在距离胫骨和腓支近端2-3 cm处，并使用插入器插入坐骨神经(NeuroPort电极插入器系统，Blackrock Neurotech，盐湖城，UT, USA)。以缠绕在电极末端的Pt/Ir导线和附着在对二甲苯- c电缆上的扁平电极作为参考电极，如图所示。2b.将注射器针制成的接地电极插入前肢皮肤，如图所示。2一个。

急性已记录和信号处理

手术后，兔子被放置在一个定制的法拉第笼，以减少电磁干扰。使用数据采集系统(Cereplex™，Blackrock Neurotech, Salt Lake City, UT, USA)以30 kHz采样率记录神经信号。此外，使用数据采集系统提供的250-5000 Hz带通滤波器去除噪声。为了尽量减少记录过程中的运动假象，我们抓住兔子的爪子，等待信号稳定下来。一旦稳定下来，兔子的脚踝被慢慢移动，注意不要移动整条腿。所有这些过程都被摄像机记录下来，神经信号和脚踝运动通过录制的视频同步。

用商业软件Matlab (Mathworks, Natick, MA, USA)和SPIKE 2 (CED, Cambridge, UK)对记录的神经信号进行分析。信噪比(SNR)的计算公式如下[17，18］．

自发神经脉冲记录

在FPMA的9个通道中，有7个通道检测到自发神经信号。单位动作电位(APs)被称为“峰值”，由7个通道中的6个记录，而一个通道(第8条)只记录复合动作电位。除了相邻的通道1和2外，记录的神经信号根据通道的不同具有不同的波形(图5)。3.a).通过观察，确认了FPMA各通道记录的信号是电极周围神经组织产生的信号，而不是肌肉信号或呼吸等外界噪声。我们还可以确认柔性FPMA是根据坐骨神经的曲线稳定地植入到神经内的，并且每个通道与不同的轴突相邻。结果表明，FPMA是一种能够记录周围神经内多个轴突的有效工具。

特别是，在通道1、2和5中检测到爆发型多单元神经信号(图5)。3.a).这些记录的多单元自发信号在一次爆发中表现出约0.3 ~ 0.4 s的峰值周期(图1)。3.b).有报道称，这类神经信号是由周围神经损伤后c-痛觉轴突的激活而产生的[19］．因此，我们推测被FPMA插入损伤的轴突可能是记录到的突发型自发神经信号的来源。另一方面，通道2表现出明显的动作电位或峰值。通道2共检测到4个穗单元。虽然单元的波形相似，但每个单元的振幅不同，因此通过商业脉冲排序程序，可以对脉冲单元进行聚类。检测动作电位的持续时间约为4 ms。穗状单元的振幅范围为130 ~ 340 μ V，信噪比为3.1 ~ 7.1(图1)。3.c).根据记录的尖刺信号，确认植入的FPMA能够有效记录外周神经的尖刺信号。

诱发感觉神经信号的记录

在确认了FPMA通过自发神经信号记录神经信号的能力后，我们尝试记录由感觉刺激产生的诱发神经信号。对植入fpma的腿进行各种刺激。其中，检测到与踝关节运动同步的神经反应(图1)。4一个)。

在通道8中，记录了踝关节运动引起的多单元神经信号，而其他通道未显示任何相关信号(图8)。4b).说明通道8记录的信号不是踝关节运动引起的伪影，而是对踝关节运动的感官刺激所产生的神经信号。此外，根据踝关节角度的不同，神经信号显示出不同的波形。根据踝关节位置的不同，两种波形交替出现。4c).当踝关节屈曲时，FPMA记录复合神经信号。另一方面，在扩展状态下，多个单元的尖刺连续发射(图5)。4d和e)。特别是，当踝关节开始运动时，会产生强烈的信号。此外，频率分析表明，当踝关节弯曲时，在短时间500ms内观察到1000hz以下的强信号。另一方面，在延伸状态下，信号在较长时间内是弱的(图5)。4c).这意味着可以根据记录的神经信号来确定踝关节的角度。

然而，我们假设本研究记录的诱发神经信号不是起源于本体感觉轴突的神经信号。在以往的研究中，本体感觉神经信号的一个特征是，在保持特定姿势的同时，具有恒定脉冲间隔的动作电位会持续发出[20.，21，22］．另一方面，通过FPMA记录的神经信号是多单位峰值信号，在特定姿势开始和消失时进行密集观察。

基于这些结果，我们得出结论，FPMA记录的神经信号不是来自负责肌肉收缩的轴突，而是来自与脚踝运动相关的感觉的轴突。虽然所记录的神经信号并非来源于本体感觉，但根据踝关节角度的不同，仍表现出特定的神经信号波形。

在本研究中，FPMA成功记录了来自周围神经多个轴突的神经信号。在所用FPMA的9个通道中，有6个通道成功地检测到了轴突的动作电位。此外，我们成功地记录了与踝关节运动同步的唤起感官信号。结果表明，FPMA能够高分辨率地记录来自周围神经的感觉神经信号。未来，我们将长期记录感觉神经信号，以验证FPMA可用于基于神经的假体提供自然的感觉反馈。

本研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。

FPMA:

柔性穿透微电极阵列

使用:

犹他斜电极阵列

PDMS:

聚二甲硅氧烷

FPCB:

柔性印刷电路板

RIE:

反应离子蚀刻

挂钩:

聚乙二醇

男朋友:

股二头肌

射频:

股直肌

TF:

阔筋膜张肌

印刷电路板:

印刷电路板

信噪比:

信噪比

记者:

动作电位

我们感谢DGIST的下一代半导体聚合技术研究所和实验动物资源中心(LARC)对本研究的支持。特别感谢LARC的Dong Jae Kim博士为动物实验提供的建议和帮助。

本研究得到了国家研究基金基础研究计划(NRF-2020R1A2C2008833)和韩国科学和信息通信科技部的DGIST研发计划(20-RT-01)的支持。

作者和隶属关系

1. 大邱庆北科学技术学院机器人与机电工程系，韩国大邱

   朴炳国，张在元，金素熙

贡献

BWP设计并进行了动物实验并进行了数据分析。JWJ制作了FPMAs并进行了动物实验。BWP和JWJ撰写了手稿。SK监督了研究工作，并修改了手稿。所有作者阅读并批准了最终稿件。

相应的作者

对应到Sohee金．

相互竞争的利益

作者声明他们没有竞争利益。

出版商的注意

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