多处狭窄对血栓形成的影响:体外研究

在患有心血管疾病的患者中，同一血管出现多个病变是最常见的情况之一，这不仅使评估每个病变的严重程度变得复杂，而且也使其治疗变得复杂。到目前为止，数值研究已经模拟了多个狭窄对不同参数的影响。很少有人为他们的研究实现了体外平台。然而，在这类病变中血栓形成的可视化仍然是需要的。这项体外研究监测血栓在有一个，两个和三个狭窄的微通道内的形成。全血以高剪切速率(> 12000 s)灌注于各通道⁻¹)，产生血栓。监测每个病变的血流变化以及最终的聚集百分比。因此，所有病例均发现可产生完全闭塞的部位为第一例狭窄。到达第二和第三个狭窄处的流量较少，这表明在第一个狭窄处聚集在增长。在测试结束时，通过测量聚合的百分比来验证这一点。

心血管疾病(cvd)是世界范围内导致死亡的主要原因，据报道，心血管疾病每年夺去的生命甚至比所有类型的癌症和慢性下呼吸道疾病加起来还要多[1］．心血管疾病导致死亡的一些后果是冠心病、中风和心脏病发作。这主要是由于动脉中的血块阻塞了正常的血液供应，即血栓形成。当动脉内的动脉粥样硬化斑块受到损伤，使斑块内的脂肪和胆固醇与血液相互作用时，就会形成血栓。因此，导致由红细胞、血小板和纤维蛋白组成的血栓的生长这个过程被称为血栓形成[2］．

动脉斑块的几何形状、大小和长度各不相同。它们也可以表现为单个或多个(或连续)病变。与单一狭窄相比，连续狭窄的流体动力学复杂，因此准确的诊断和治疗仍然是医学上的挑战[3.］．Keeley等人[4]的研究发现，69%的st段抬高型心肌梗死患者有多发复杂狭窄，其中26%的患者有2个狭窄，17%的患者有3个狭窄。根据Goldstein等人的研究结果[5]与单发狭窄患者相比，连环狭窄患者有更高的缺血再发风险和更高的死亡率。

高壁剪切率在冠状动脉血栓形成中起重要作用[6］．它们负责启动血小板聚集机制[7］．一项体内研究表明，血小板聚集不仅由可溶性激动剂引起，也由剪切应力梯度引起[8］．壁面剪切速率是壁面剪切应力除以流体粘度的结果[9］．数值研究模拟了一系列狭窄中存在的流动动力学，表明壁面剪切应力随着狭窄百分比的增加而增加[10］．但多发狭窄的存在对血流损害的影响大于相同程度的单一狭窄[11，12］．

在评估多发狭窄时，最重要的参数之一是压降。压力梯度主要用于测量分数流量储备(FFR)等诊断技术。FFR指数有助于评估病变严重程度和决定治疗方案[13］．已发现压降随容器内狭窄的数目而变化[10，14］．而且，当近端和远端狭窄距离增加时，会产生更大的压力梯度[15］．已发现狭窄后段由于再循环区和流动分离而容易产生颗粒聚集[14]，这可能导致血栓形成。

通过这些研究，可以估计出血栓形成的原部位，然而，在体外实验中证明这些预测在血栓形成中仍然缺乏。这项研究证明了狭窄的数量对血栓形成的影响，血栓形成的位置，以及多个狭窄如何增加血栓形成和完全闭塞的风险。这些结果有助于更广泛地了解血栓如何在多发性狭窄中发展。此外，血栓形成监测和最终聚集测量允许确定病变倾向于闭塞。

制造

设计了具有一个(A)、两个(b)和三个(c)狭窄通道的微流控芯片。所有病变均选择85%的临床严重狭窄。由于目的是发现狭窄数量的影响，所有的设计都是一样的。狭窄通道的几何形状为同心。通道直径为600 μm，狭窄部位直径为90 μm。病灶间距离设为5mm(图;1)．

利用光刻技术对硅片进行了制模，并利用软光刻技术制作了主模。芯片由PDMS 10:1制成，采用我们实验室开发的热风膨胀方法[16］．这种方法允许制造自对准椭圆通道，其目的是模仿人类动脉的形状。

从大鼠尾部提取的I型胶原蛋白(1mg /ml, Sigma-Aldrich，韩国)用于在通道内形成血栓前涂层。通道在室温下孵育一夜，实验前用PBS 1X冲洗[17］．

从一名志愿者抽取全血，并将其收集在装有CPDA-1抗凝血剂的袋子中;在使用前，用适量的氯化钙重新钙化₂0.25 m，用注射器泵控制血流速率为3ml /h，从注射器到通道入口用管子连接。使用光学显微镜(DMSZ7, Sunny optical, China)观察血流和血栓形成。压降由放置在进口和出口的两个压力传感器(ABP系列，霍尼韦尔，美国)监测。实验所用的装置和芯片如图所示。2．

分析

为了确定血栓形成对第二次和/或第三次狭窄的影响程度，分别观察每个病变。视频记录被用于分析。获取每个感兴趣时间点的帧，使用ImageJ软件对图像进行处理。使用掩码来定义要分析的区域，并裁剪感兴趣的区域。然后，利用HSB(色调-饱和度-亮度)方法进行颜色阈值确定清晰区域。得到整个感兴趣区域和清晰区域的大小，并计算百分比。

为了确定到达每个狭窄的流量，使用灌注期间的图像，并计算前600秒的清晰面积百分比。正常情况下，当出现清晰区域时，该区域表明存在血栓[18］．然而，在我们的对照实验中，我们观察到三种不同的现象，这可能是解释这些清晰区域的原因。如图所示。3.，色差的原因之一是聚集物的形成，它们看起来像颜色较浅的凝块，因为它们主要由血小板组成。此外，当出现聚合时，流将偏离其正常路径，创建浅色字符串。第三个原因是所谓的“无细胞层”现象。当血液流经微血管时，红细胞倾向于聚集在流动的中间，在边缘留下一层没有细胞的血浆。无细胞层的颜色与正常的血液颜色不同。

由于清晰区域的外观可能不明确，因此采取另一项测量来验证每个狭窄闭塞的风险。图像是在实验结束时血液不再流动时拍摄的，这些图像也被考虑在分析中。计算每个病灶清晰区域的百分比，并将其宣布为聚集。由于流动已经停止，两种可能的原因被丢弃:流动变化和无细胞层。

在仅有一处狭窄的通道中测量清晰面积百分比。通过分析，观察血流过程中狭窄部位的变化，如聚集、溶解或栓塞。数字4显示在灌注600秒期间，这些变化明显的某些点的清晰区域的百分比。

当血液开始流动时，观察到清晰区域的增加，这是由于通道内形成的聚集。然后，清晰的区域减少，这意味着凝块被溶解，因此，血液在通道中占据了更多的空间。在600 s时也观察到重新聚集。

对第二、三狭窄进行同样的观察和分析。与第一个不同的是，在这些病变中，没有观察到聚集。相反，清晰面积百分比的不断增加被注意到(图。5)．这意味着到达这些狭窄处的血流量在减少。在第一狭窄处形成的聚集可以解释这些变化。第一个病变处的血栓生长导致血流阻力增大;因此，到达第二和第三狭窄处的流量较少。

为了确认灌注过程中发现的结果，在实验结束时测量了聚集率，结果如图所示。6．分析三通道各狭窄处的聚集百分比，所有病例均在第一次狭窄处聚集百分比最高。因此，证明了第一次狭窄是导致第二、第三次狭窄发生变化的原因。即使第二个和第三个狭窄也显示出相当比例的聚集，第一个显示的最多。

通过本研究获得的结果，使我们对多发狭窄血管血栓形成的发展有了更深的了解。在高剪切速率下证实血栓形成。血流灌注时，第一个狭窄处出现聚集、栓塞或溶解，说明血栓不稳定，但未达到完全闭塞。

据观察，在所有狭窄具有相同严重程度的情况下，完全闭塞的责任将是第一个。这可以解释为，即使每个病变的剪切速率几乎相同，但第一个病变是第一个接触血液的，因此血栓形成机制从那里开始。在第二和第三狭窄处未观察到血栓，但发现有较少的流量到达它们。在这些病变中也发现了较低百分比的聚集。

本研究证实了85%的严重狭窄行为，但也遇到了一些局限性。首先，我们的设计展示了一个理想的情况，所有的狭窄都有相同的严重程度，所有的狭窄都是由某处破裂的胶原蛋白产物造成的。除了胶原蛋白涂层未被定位外，这些实验还使用了可溶性胶原蛋白，其中含有较少的血管性血友病因子蛋白，而血管性血友病因子蛋白是动脉血栓形成所必需的[19］．这可能是没有达到完全闭塞和聚集百分比不太显著的原因。此外，使用的样本数量有限，因此，研究结果需要进一步验证。在分析方面，笔者根据观察划定了明确的区域。但是，在正常情况下，气流应该在发散后恢复。对此的一种解释可能是血液成分的分离，因为它发生在无细胞层(CFL)中。清晰的区域可能是等离子体，因为已经发现微流体的几何变化增强了CFL。这已被用于血浆分离[20.］．在监测方面，使用了光学显微镜，因此得到的图像是2D的，不允许观察聚集体的体积，因此测量了面积。所有病变分别监测;通过实施同时监测，可以更广泛地观察所有狭窄的血栓和血流行为，这可以在以后得到改善。

这项研究证明了这种疾病患者常见的几种情况之一。类似的制作方法、实验设置和评估技术在未来可以应用于更复杂的冠状动脉病变。例如分叉病变内的动脉粥样硬化斑块，这是最难诊断和治疗的病变之一。此外，该设备还可以内衬内皮细胞，以提供生化效果，使其更类似于活动脉。

使用微流体体外模型研究了多发狭窄血栓形成的发展。在严重狭窄(85%狭窄)和高剪切率处证实了血栓的形成。通过以下狭窄处观察到流量减少。由于意外的溶解，没有达到完全闭塞。起初，我们预计来自第一个狭窄的栓子会在接下来的狭窄中产生闭塞，但没有观察到这一点。所有狭窄处都有血块生长;但在第一次狭窄处聚集率最高。根据我们的研究结果，第一段狭窄最容易发生完全闭塞，因此应及早治疗。

在这项研究中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章中。

心血管病:

心血管疾病

笔:

分流储量

HSB:

Hue-saturation-brightness

节能灯:

颗粒层

不适用。

这项工作得到了韩国国家研究基金会基础研究计划(NFR 2020R1F1A1074995)的支持。血液样本经首尔国立科技大学IRB批准(2020-0025-01)采集。

作者及隶属关系

1. 首尔国立科技大学生物医学工程与生物材料融合研究所，韩国首尔

   Helem B. Flores Marcial & Woo-Tae Park

2. 首尔国立科技大学机械与汽车工程系，首尔，韩国

   Jiseob Choi, Donghwi Ham, Junghyun Kim, Pyeongho Jeong & Woo-Tae Park

3. 三星医疗中心，韩国首尔

   Jinho崔

贡献

WTP监督了这项工作的发现，并审查了手稿。CJS, HBFM, HDH, JHK和PHJ制作了该装置。JHC、WTP、CJS、HBFM和HDH设计了实验范围并进行了实验。HBFM起草了手稿。WTP阅读并批准最终稿。

相应的作者

对应到Woo-Tae公园．

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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