定量图像分析在微流体体外血栓形成模型

在这项研究中,我们提出一个方法来定量分析血栓形成过程通过图像分析在一个圆形截面的体外血栓模型。使用的血栓模型设计了基于壁剪切速率的机制之间的物理原理(WSR)和血栓形成。图像分析是用来帮助可视化血栓形成过程和计算血栓区。通过这种方法,血栓形成和增长的通道墙壁被证明没有荧光的使用。此外,通过将图像分成小节,血栓增长模式的准确性提高。被称为栓子的即将离任的血栓,观察血栓分开。

血栓是指一块血液在血管中血栓形成是一个条件的血管被血块阻塞。血栓形成了各种症状取决于器官的位置和类型的血管。一般来说,缺血发生在动脉血栓形成(188bet官方平台 ],拥堵是典型的静脉血栓形成(188bet官方平台 ]。血栓形成是由于血液流动缓慢,过度凝固,和血管损伤,每个行为单独或结合形成血栓。血栓形成是受物理剪切速率的影响,这就增加了血小板浓度附近的血管壁和激活血小板在那个地区188bet官方平台 ]。因此,重要的是要观察和分析血栓形成和墙剪切速率之间的关系(WSR) [188bet官方平台 ]- [188bet官方平台 ]。尤其是,有医疗需要快速测定评估血栓形成的风险;抗凝治疗与non-anticoagulated血液在动脉血液流动条件下执行,护理点(POC)设备是必要的快速监测动脉血栓形成的风险和优化体外抗凝治疗(188bet官方平台 ]。准确地检测血栓,先前的研究已经使用荧光DiOC等物质₆提高血小板可见性(188bet官方平台 ]。然而,血小板检测使用荧光材料需要一个特殊的显微镜能够检测荧光和影响物理性质,如血药浓度和血液粘度,从而增加总试验时间(188bet官方平台 ]。在这项研究中,通过图像分析,这是一个处理过程,提高了血栓的可见性,观察血栓的生长过程,和区域血栓的定量计算,比较,分析。这种分析方法是用来描述血栓的形成过程增加了WSR体外血栓模型中不同狭窄百分比。预计生产高度可再生的剪切率血栓模型作为"可以应用于shear-sensitive药物的发展,纳米颗粒,脂质体(188bet官方平台 ]。最后,本研究旨在提供洞察新的血栓形成倾向测试系统的开发(188bet官方平台 ]。

通道有一个圆形的横截面,因为通道使用热膨胀原理[成立188bet官方平台 ]。热膨胀成型的原理,形成一个圆形频道部分治愈聚二甲硅氧烷(美国陶氏PDMS SYLGARD 184)由热空气被困在模具扩张。狭窄的比例部分和微通道的横断面是由控制部分的固化温度和固化时间PDMS治愈。因为这种方法使用热量同时扩张和养护,是有限度的大渠道的扩张(> 200μm) (188bet官方平台 ),和横截面的椭圆形状,而不是一个完美的圆。然而,由于截面不是矩形,WSR的优势是有一个分布类似于人类血管(188bet官方平台 ]。3 d模型和横截面形状的通道狭窄83.73%图所示。188bet官方平台 。使用水力直径狭窄百分比计算的通道。公式计算水力直径和狭窄百分比由他提供et al。188bet官方平台 ]

在哪里w和h的长度长,短的通道,分别。渠道的水力直径计算部分(图。188bet官方平台 (图b)和狭窄部分。188bet官方平台 c)被命名为D_h,通道和D_h,狭窄,分别。所使用的模型是PDMS渠道狭窄部分的71.2%和83.73%。评估血栓的关系和WSR,最大WSR计算如下:

在哪里ϒWSR,问通道的流量,D是通道直径。以前的研究报道,血小板扩散的程度或聚合交换机WSR是10000年代⁻¹(15,16,17,188bet官方平台 ]。在这项研究中,血栓形成将不同条件下的WSR小于10000年代⁻¹和超过10000年代⁻¹。每个通道都有一个WSR 7602.36 s⁻¹狭窄71.2%和29850 .27年代⁻¹83.73%狭窄血流时设置为3毫升/小时。最大的WSR 10年代⁻¹2000小静脉和动脉(188bet官方平台 ),和严重的动脉狭窄发生的WSR 5000到10000年代⁻¹。因此,设计渠道有足够WSR形成血栓。维度、狭窄百分比和最大WSR在这项研究中使用的两个渠道表中列出188bet官方平台 。

血制备

全血收集在柠檬酸管(2毫升9数控凝固柠檬酸钠3.2%;Greiner Bio-One GmbH,奥地利)和使用相同的一天。柠檬酸钙离子结合,以阻止他们与凝血系统交互。重新激活凝血系统,打断了柠檬酸(188bet官方平台 实验前,全血与CaCl混合₂0.25米(西格玛奥德里奇c1016 - 500 g,中国),维持在37°C的体积比10:1。recalcified血液灌注进频道就不一。

胶原蛋白涂层

促进血小板凝固的PDMS表面通道,通道是孵化1毫克/毫升胶原蛋白(C3867-1VL I型的解决方案,从老鼠尾巴,西格玛奥德里奇,韩国)22°C以上8 h,一天前的实验。血液灌注之前,渠道是冲洗1 x磷酸盐(美国西格玛奥德里奇PBS, P5493-1L) 1分钟去除过量的胶原蛋白。通道为肿块或粒子的密切监视。

血液灌注

实验设置见图。188bet官方平台 。Recalcified血液灌注到血栓芯片在3毫升/小时使用注射泵(ne - 4000泵新时代,美国),和血液通过芯片收集进排气瓶子。实时观察血液凝结的芯片使用数字显微镜(DMSZ7,阳光明媚的光学技术,中国)。图像获取与显微镜后被转移到一个计算机图像分析的实验,进行后期处理。

后处理:图像分析

在这项研究中,图像分析,后处理过程,用于可视化的过程中血栓形成和血栓的面积计算。一个开源ImageJ软件被用于这一过程。所有的图片都相同数量的像素(235×105像素)。

图188bet官方平台 显示了一个RGB图像保存在一个便携式网络图形(PNG)格式记录的图像。的PNG格式选择无损压缩。在原始图像(图。188bet官方平台 ),有识别血栓地区的局限性,因为它是无色和动态地改变形状188bet官方平台 ]。

在第一步中,整体色调范围减少(增加对比),和色调值增加(增加亮度)。这突显出血栓区域通过澄清之间的边界对象(血栓)和背景(188bet官方平台 ]。

在第二步中,图像转换为灰度图像,如无花果所示。188bet官方平台 c。这个过程是为下一步做准备,也就是说,二值化的步骤。转换图像二值化是一个过程以来只有两种颜色,白色和黑色,必须转化为图像像素只有对比度不包括颜色信息。

在第三步中,血栓地区分开non-thrombus地区通过图像的二值化。二值化的步骤主要包括设置一个特定的阈值为黑色和白色(188bet官方平台 ]。如无花果所示。188bet官方平台 d,血栓是用白色表示,non-thrombus地区是用黑色表示。这个阈值设置的步骤包括主观观察和决策。操作员应该仔细设置阈值,这样任何明显的血栓的细节是不会丢失。

在最后一步中,血栓面积比率的计算血栓区域总面积的二进制图像。这个过程是迭代的进步表现在每个时间间隔计算血栓形成。

图188bet官方平台 显示测量结果的面积血栓形成的通道狭窄百分比(71.2%和83.73%的间隔。71.2%的通道,血栓增长率变化后7分钟。这是基于原则的血栓形成、血小板的连接通道的内壁血栓的早期生长和总附加的血小板(188bet官方平台 ]。在83.73%的情况下通道,血栓增长速度超过71.2%通道情况。但是,没有区分斜率变化是观察到血小板粘附和聚集之间的阶段。

血栓生长过程图所示。188bet官方平台 。71.2%的进步通道图所示。188bet官方平台 血栓形成。慢慢地从内壁长达7分钟。此后,内壁的血栓逐渐增长的规模。83.73%的进步通道图所示。188bet官方平台 b。生成血栓通道墙上1分钟,只要1分钟过去了,它在狭窄迅速增长。预计通道狭窄WSR更高比例更高;因此,文献[188bet官方平台 血小板)这将是容易迁移到通道墙,和血小板粘附是预测很快发生。血栓增长率相比,通道狭窄71.2%µm 154575 .55形式需要12分钟²血栓而与83.73%狭窄产生类似地区4分钟。也就是说,通道狭窄83.73%形成了血栓大约三倍,71.2%的狭窄。

此外,它被证实,大部分的血栓形成的通道狭窄71.2%部分在前面开发的狭窄部分,而血栓形成的通道与83.73%狭窄主要是发达的后部狭窄部分。最大的WSR从7600年代每个通道的狭窄⁻¹通道狭窄和29000年代的71.2%⁻¹有83.3%的狭窄,如表所示188bet官方平台 。这表明仿真结果的趋势类似于Yazdani et al。188bet官方平台 ),血小板聚集在前面的部分狭窄部分在2400 - 5400年代的剪切率⁻¹,他们聚集在狭窄的后部部分主要在11000 - 21000年代⁻¹。

值得注意的是,这是证实血栓区域暂时减少3和7分钟的通道狭窄,83.73%与71.2%狭窄的通道是由一些血栓的超然因为WSR高。被称为一个独立的血栓栓子。高WSR通道墙壁附近增加血小板的浓度,促进血小板活化;相反,它还把血栓(血栓机构188bet官方平台 ]。血栓形成过程中6 - 7分钟间隔的栓子发生图所示。188bet官方平台 。这是视觉上证实血栓的一部分(栓子)已经形成在6分钟1分钟后消失了。

image-analysis-based血栓可视化和面积计算方法用于这项研究可能有较低的精度分析覆盖面积增加。图188bet官方平台 切片时显示了血栓的差异分析。一般来说,如果一个图像的宽度是三倍以上的高度形象,建议分析范围被分成几部分,每部分分别进行了分析。图的左边。188bet官方平台 显示了血栓血栓区域的图像和计算结果分析部分时,不是分裂的,而右边的图。188bet官方平台 显示血栓图像和计算分析部分时,血栓区域的划分。作为一个经验法则,每个部分应该被划分,划分图像宽度不超过三倍图像高度。在图所示。188bet官方平台 ,总图像进一步划分每500µm这部分被分为正常通道区(第一节,6),进入和离开区域(部分2、5)和狭窄区(第三节,4)。六个部分分别进行了分析并与情况分析部分没有分裂。我们观察到section-divided分析显示更多的细节,这是迷失在出发分析。这种差异的原因主要是对比分辨率的图像分析。如果图像被分成几部分,每个分裂图像分别计算获得灰度值的范围。出发的图像设置为灰度范围。定量,分析血栓面积在无花果。188bet官方平台 约有8%的差异从切片(531325 .075 vs 489191 .296µm吗²)。

分别分析了图像分析结果显示区域血栓增长过程。图188bet官方平台 显示了图像分析的结果对血栓形成后的区域狭窄部分(章节4、5、6),大部分血栓形成。在部分4和5,接近狭窄部分,血栓的生长速度是最快的血液灌注的早期阶段。相反,在第六节,最远的狭窄部分,血栓生长和超然(栓子)经常发生。这意味着在血小板血栓之间的增长率增长附加到通道墙(wall-platelet)是一种比这更快和更强的债券之间的血栓形成在血小板聚集(platelet-platelet)。此外,7分钟后,血液流动,血栓面积5节逆转形成血栓形成在第四节。预计WSR狭窄造成的部分,以及WSR血栓形成引起的在第四节,随着时间的增加,从而促进血栓增长。

由于血栓分析方法介绍了研究基于二维投影图像,很难精确测量的绝对数量的血栓形成。但是,这种方法可以确定的位置形成血栓,血栓的相对大小进行比较。这提供了一种观察和了解血栓形成过程的基础。

在这项研究中,定量分析方法在体外血栓形成血栓的机制描述了芯片使用简单的实验设备和图像分析不使用荧光材料。这项研究提供了一个基本的介入使血栓分析理解和治疗血栓疾病使用简单的实验室设备。所示的血栓分析结果本研究主要是基于物理流对血栓形成的影响。通过图像分析方法引入在这项研究中,可以直观地监测血栓形成过程在时间和面积计算血栓形成。我们发现更高的狭窄通道,血栓生长速率越快,栓子发生的概率就越高。它也表明,血栓形成从通道墙壁和增长。此外,除以图像分析部分和分析部分,这是确认同样的血栓的生长速度和约束力可以取决于他们是如何形成的。我们相信,我们的研究结果提供依据的体外血栓用品制造POC动脉血栓形成的诊断和抗凝治疗的快速诊断。

本研究中所有生成的数据或分析包括在发表的这篇文章。

WSR:

墙剪切速率

POC:

点的护理

PNG:

便携式网络图形

PBS:

磷酸盐

PDMS:

聚二甲硅氧烷

不适用。

本研究进行了韩国国家研究基金会的支持下进行(2020 r1f1a107499512)和批准后的首尔国立科技大学IRB (2020-0025-01)。

作者和联系

1. 机械工程系,首尔国立大学的科学和技术,韩国,首尔

   崔Ji-Seob Dong-Hwi火腿,Pyeong-Ho Jung-Hyun Kim Jeong & Woo-Tae公园

2. 融合生物医学工程和生物材料研究所、首尔国立科技大学,首尔,韩国

   希Betsua弗洛雷斯马歇尔·& Woo-Tae公园

3. 三星医疗中心,首尔,韩国

   Jin-Ho崔

贡献

W.T.P.监督这项工作经费和回顾了手稿。C.J.S.,K.J.H., H.D.H., H.B.F.M. and P.H.J. fabricated the device. J.H.C., W.T.P., C.J.S., H.D.H. and H.B.F.M. designed the scope and performed the experiments. CJS drafted the manuscript. W.T.P. read and approved the final manuscript.

相应的作者

对应到Woo-Tae公园。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

出版商的注意

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