微流控体外模型血栓形成的定量图像分析

在本研究中，我们提出了一种通过图像分析定量分析血栓形成过程的方法，在体外血栓模型与圆形截面。所使用的血栓模型是基于壁剪切速率(WSR)物理原理与血栓形成之间的机制设计的。图像分析有助于可视化血栓形成过程，并计算血栓面积。通过这种方法，在不使用荧光的情况下，可以证明血栓从通道壁形成和生长。此外，通过将图像划分为子切片，提高了血栓生长模式的准确性。分离的血块被称为栓子，被观察到从血栓中分离出来。

血栓是指血管里的血块，血栓是指血管被血块堵塞的情况。血栓形成的症状因器官的位置和血管类型的不同而不同。一般来说，动脉血栓形成时，会出现局部缺血[1]，充血是静脉血栓形成的典型表现[2］．血栓形成是由血液流动缓慢、凝血过度、血管损伤引起的，这些因素单独或共同作用形成血栓。血栓的形成受物理剪切速率的影响，它增加了血管壁附近的血小板浓度，并激活了该区域的血小板[3.］．因此，观察和分析血栓形成与wall shear rate (WSR)之间的关系非常重要[3.] - [6］．特别是，医学上需要一种快速测定方法来评估血栓风险;在动脉血流条件下使用非抗凝血和护理点(POC)设备进行抗血栓治疗对于快速监测动脉血栓形成风险和优化体外抗血栓治疗是必要的[3.］．为了准确检测血栓，以前的研究使用了荧光物质，如DiOC₆提高血小板能见度[7］．然而，使用荧光材料检测血小板需要能够检测荧光的特殊显微镜，并影响物理性质，如血液浓度和血液粘度，这会增加总的实验时间[8］．在本研究中，通过图像分析，这是一个后处理过程，提高了血栓的可见性，观察了血栓的生长过程，定量计算、比较和分析了血栓面积。采用该分析方法描述了不同狭窄比例体外血栓模型中WSR生长血栓的形成过程。预计，作为芯片实验室，制造高度可重复的基于剪切速率的血栓模型可应用于剪切敏感药物、纳米颗粒和脂质体的开发[9］．最终，本研究旨在为新的血栓倾向测试系统的发展提供见解[10］．

通道的横截面呈圆形，因为通道是利用热膨胀原理形成的[11］．热膨胀成型原理是通过热膨胀困在模具内的空气，在部分固化的聚二甲基硅氧烷(PDMS, SYLGARD 184, DOW, USA)中形成圆形通道。通过控制部分固化PDMS的固化温度和固化时间，确定微通道狭窄截面与横截面的比例。由于该方法同时使用热进行膨胀和固化，因此对于较大通道(> 200 μm)的膨胀有一定的限制[12]，且截面呈椭圆形状，而不是正圆。然而，由于横截面不是矩形的，其优点是WSR的分布与人类血管的分布相似[13］．图中为一个狭窄83.73%的通道的三维模型和截面形状。1．用通道的水力直径计算狭窄率。计算液压直径和狭窄率的公式由Lui等人提供。[14］

在哪里w而且h分别是通道的长边和短边的长度。从通道部分计算的水力直径(图;1b)和狭窄部分(图;1C)被命名。D_h,通道而且D_h,狭窄,分别。模型为PDMS通道，狭窄部位分别为71.2%和83.73%。为评估血栓与WSR之间的关系，计算最大WSR如下:

在哪里ϒ是WSR，问是通道中的流速，和D为通道直径。先前的研究报道，血小板扩散或聚集开关在WSR周围的程度为10,000 s⁻¹［15，16，17，18］．在本研究中，预计在WSR小于10,000 s的条件下，血栓形成会发生变化⁻¹超过10000个s⁻¹．每个通道的WSR为7602.36 s⁻¹71.2%狭窄，29850.27 s⁻¹血流为3 mL/h时，狭窄率为83.73%。最大WSR为10 s⁻¹静脉是2000，小动脉是2000 [3.]，在WSR为5000 ~ 10,000 s时发生严重动脉狭窄⁻¹．因此，所设计的通道具有足够的WSR形成血栓。本研究使用的两个通道的尺寸、狭窄率和最大WSR见表1．

血制备

全血采集于柠檬酸管(2 mL 9NC凝固柠檬酸钠3.2%;奥地利Greiner Bio-One GmbH)，并在同一天使用。柠檬酸盐结合钙离子，以防止它们与凝固系统相互作用。重新激活被柠檬酸盐中断的凝血系统[19]在实验前，将全血与氯化钙混合₂0.25 M (C1016-500G, Sigma Aldrich，中国)，保持在37°C，体积比为10:1。再钙化的血液在混合后立即灌注到通道中。

胶原蛋白涂层

为促进PDMS通道表面血小板凝固，实验前一天，在22℃条件下，用1mg /mL胶原蛋白(C3867-1VL, Type I solution from rat tail, Sigma Aldrich, South Korea)孵育PDMS通道8小时以上。在血液灌注前，用1X磷酸盐缓冲盐水(PBS, P5493-1L, Sigma Aldrich，美国)冲洗通道1分钟以去除多余的胶原蛋白。这些通道被密切监测，以防出现块状或颗粒。

血液灌注

实验装置如图所示。2．使用注射泵(NE-4000 New Era pump, USA)以3ml /h的速度将再钙化血液灌注到血栓芯片中，通过芯片的血液收集到排气瓶中。使用数码显微镜(DMSZ7, SUNNY OPTICAL TECHNOLOGY, China)实时观察芯片上的血凝情况。实验结束后，将显微镜采集的图像传输到计算机中，进行后处理，进行图像分析。

后处理:图像分析

在本研究中，使用图像分析这一后处理过程来可视化血栓形成的过程，并计算血栓的面积。这个过程使用了开源ImageJ软件。所有的图像都有相同的像素数(235 × 105像素)。

数字3.a显示从记录的图像中保存为便携式网络图形(PNG)格式的RGB图像。无损压缩选择PNG格式。在原始图像中(图。3.A)，由于血栓区域无色且形状动态变化，在识别血栓区域时存在局限性[20.］．

在第一步中，整体色调范围减小(对比度增加)，色调值增加(亮度增加)。这通过明确物体(血栓)和背景之间的边界来突出血栓区域[21］．

第二步，将图像转换为灰度图像，如图所示。3.c.这个过程是为下一步，即二值化步骤做准备。由于二值化是将只有黑白两种颜色的图像转换为像素的过程，因此必须将图像转换为只有对比度而不包含颜色信息的像素。

第三步，对图像进行二值化，将血栓区域与非血栓区域分离。二值化步骤主要涉及为黑色和白色设置特定的阈值[22］．如图所示。3.D，血栓表达为白色，非血栓区域表达为黑色。这个阈值设置步骤涉及主观的观察和决定。操作者应仔细设置阈值，以免丢失任何明显的血栓细节。

最后一步，根据血栓面积与二值图像总面积的比值计算血栓面积。这一过程在每个时间间隔迭代执行，以计算随着时间的推移血栓形成的进展。

数字4显示了间隔1min测量狭窄率为71.2%和83.73%的通道内血栓形成面积的结果。以71.2%通道为例，7 min后，血栓生长速率发生变化。这是基于血栓形成的原理，血栓生长初期，血小板附着在通道内壁，并聚集在附着的血小板上[23］．在83.73%通道的情况下，血栓比71.2%通道的情况下增长更快。然而，在血小板粘附和聚集阶段之间没有观察到明显的斜率变化。

血栓生长过程如图所示。5．71.2%通道的进展如图所示。5a.血栓从内壁缓慢形成长达7分钟。此后，血栓从内壁逐渐增大。83.73%通道的进展如图所示。5b.血栓在通道壁上形成长达1分钟，1分钟过后，血栓在狭窄处周围迅速生长。预计狭窄率越高的通道WSR越高;因此，参考[20.]血小板更容易迁移到通道壁上，并且血小板粘附被预测发生得同样快。与血栓生长速度相比，狭窄71.2%的通道形成154,575.55µm需要12 min²而狭窄83.73%的通道形成血栓的时间为4min，即狭窄83.73%的通道形成血栓的速度约为狭窄71.2%通道的3倍。

此外，经证实，狭窄71.2%的通道内形成的血栓多发生在狭窄段的前部，而狭窄83.73%的通道内形成的血栓多发生在狭窄段的后部。各通道狭窄的最大WSR为7600 s⁻¹狭窄71.2%，29,000 s⁻¹83.3%狭窄，见表1．这与Yazdani等人的模拟结果相似。[24]血小板以2400 ~ 5400 s的剪切速率聚集在狭窄段前部⁻¹在11000 ~ 21000 s主要聚集在狭窄段后部⁻¹．

值得注意的是，在83.73%狭窄的通道中，在3和7 min时，血栓面积暂时减小，而在71.2%狭窄的通道中，血栓面积减小是由于WSR过高导致部分血栓脱离造成的。脱离的血栓称为栓子。高WSR增加通道壁附近的血小板浓度，促进血小板活化;相反，它也将血栓从血栓体中分离出来[24］．图中所示为栓子发生间隔时间内6-7分钟内血栓形成过程。6．从视觉上证实，在6分钟时已经形成的一部分血栓(栓子)在1分钟后消失了。

本研究中使用的基于图像分析的血栓可视化和面积计算方法，随着分析覆盖面积的增加，准确性可能会降低。数字7显示了切开该区域时血栓分析的差异。一般情况下，如果图像宽度大于图像高度的三倍，建议将分析范围划分为分段，每个分段单独分析。无花果的左边。7为未划分分析断面时的血栓图像及血栓面积的计算结果，而图的右侧为。7显示分析断面划分时的血栓图像和血栓面积的计算。根据经验，每个部分都应该被分割，分割后的图像宽度不超过图像高度的三倍。在图所示的情况下。7时，每隔500µm对整个图像进行进一步划分，将切片分为正常通道区(第1、6段)、进出通道区(第2、5段)和狭窄区(第3、4段)。分别对6个切片进行分析，并与未划分分析切片的情况进行比较。我们观察到分段分析显示了更多的细节，这在非分段分析中丢失了。造成这种差异的原因主要是每张分析图像的对比度分辨率。如果将图像分割为分段，则每个分割后的图像分别计算得到一个灰度值范围。未分割的图像设置为灰度范围。定量地，图中分析的血栓面积。7与切片(531,325.075 vs. 489,191.296µm²）.

单独分析的图像分析结果显示了特定区域的血栓生长过程。数字8图为狭窄段(4、5、6段)后血栓形成的图像分析结果，此处血栓形成最多。在靠近狭窄段的section 4和section 5中，血流灌注早期血栓生长速度最快。而在距离狭窄段最远的6段，血栓生长和脱离(栓子)频繁发生。这意味着附着在通道壁上的血小板周围生长的血栓(壁式血小板)之间的生长速度比血小板聚集过程中形成的血栓(血小板-血小板)之间的结合速度更快、更强。此外，血流7 min后，第5段形成的血栓区域与第4段形成的血栓区域相反。预计狭窄段引起的WSR以及4段形成的血栓引起的WSR随着时间的推移而增加，从而促进血栓的生长。

由于本研究引入的血栓分析方法是基于二维投影图像，很难准确测量血栓形成的绝对数量。然而，这种方法可以确定形成的血栓的位置，并比较血栓的相对大小。这为观察和了解血栓形成过程提供了依据。

在本研究中，描述了一种在体外血栓芯片中定量分析血栓形成机制的方法，使用简单的实验设备和图像分析，而不使用荧光材料。这项研究提供了一个基本步骤，使血栓分析了解和治疗血栓疾病使用简单的实验室设备。本研究显示的血栓分析结果主要基于物理流量对血栓形成的影响。通过本研究介绍的图像分析方法，可以直观地监测血栓形成过程随时间的变化，并计算血栓形成面积。我们发现狭窄通道越高，血栓生长速度越快，栓子发生的概率越高。它还表明，血栓形成从通道壁开始，并在其周围生长。进一步，通过分割图像分析切片并进行切片分析，证实了同一血栓的生长速度和结合力会因血栓形成方式的不同而不同。我们认为，我们的研究结果为制备POC诊断动脉血栓的体外血栓试剂盒和快速诊断抗血栓治疗提供了依据。

在这项研究中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章中。

WSR:

壁面剪切速率

POC:

护理点

PNG:

便携式网络图形

PBS:

磷酸盐

PDMS:

聚二甲硅氧烷

不适用。

本研究得到韩国国家研究基金(2020R1F1A107499512)的支持，并经首尔国立科技大学IRB(2020-0025-01)批准后进行。

作者及隶属关系

1. 首尔国立科技大学机械工程系，首尔，韩国

   崔智燮，咸东辉，金贞贤，郑平浩，朴佑泰

2. 首尔国立科技大学生物医学工程与生物材料融合研究所，韩国首尔

   Helem Betsua Flores Marcial & Woo-Tae Park

3. 三星医疗中心，韩国首尔

   Jin-Ho崔

贡献

W.T.P.监督了这项工作的资金，并审查了手稿。c.j.s.， k.j.h.， h.d.h.， H.B.F.M.和P.H.J.制作了这个装置。j.h.c.， w.t.p.， c.j.s.， H.D.H.和H.B.F.M.设计了瞄准镜并进行了实验。CJS起草了手稿。W.T.P.阅读并批准了最终稿。

相应的作者

对应到Woo-Tae公园．

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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